発現ベクター
従来の発現ベクターは、大腸菌由来のプラスミドと形質転換菌由来のプラスミドとを融合した、大腸菌と形質転換菌との双方で機能するシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌のみで機能する発現ベクターは知られていなかった。本発明は、大腸菌以外の形質転換菌のみで複製され、当該形質転換菌以外の菌では複製されない発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物からなる遺伝子輸送担体等を提供することにある。
本発明の発現ベクターは、嫌気性菌で機能するプラスミドベクターであって、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクターである。より具体的には、（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる蛋白質発現ユニットを含む発現ベクターである。これにより、形質転換遺伝子が、形質転換菌以外の病原性または好気性菌等で複製されるおそれがない、極めて安全なベクターおよび遺伝子輸送担体を実現することができる。
本発明の発現ベクターは、嫌気性菌で機能するプラスミドベクターであって、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクターである。より具体的には、（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる蛋白質発現ユニットを含む発現ベクターである。これにより、形質転換遺伝子が、形質転換菌以外の病原性または好気性菌等で複製されるおそれがない、極めて安全なベクターおよび遺伝子輸送担体を実現することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気的疾患治療用遺伝子輸送担体として有用な形質転換嫌気性微生物の作製に用いられる発現ベクター及びその作製方法に関する。また、本発明は、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該遺伝子輸送担体を含有する嫌気的疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学分野において、微生物を形質転換するために用いる発現ベクターとしては、ファージ、動植物ウィルス、プラスミドなどが広く用いられている。そして、形質転換して遺伝子産物の目的蛋白質を発現させる形質転換微生物として、大腸菌や酵母などが広く用いられている。これらの形質転換微生物は、目的蛋白質を発現させるためのものであり、微生物そのものを利用するものではない。
【０００３】
近年、形質転換した微生物そのものを利用する方法に関して、悪性腫瘍の治療方法において、形質転換嫌気性菌を遺伝子輸送担体として用いる方法が注目され、例えば、形質転換したクロストリジウムを用いた腫瘍部位への遺伝子輸送方法が提案されており（例えば、特許文献１〜３参照）、さらに、形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガムについて、固形腫瘍に対する治療への応用が示唆されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００４】
また、固形腫瘍治療用の遺伝子輸送担体として有用な形質転換ビフィズス菌に関して、シトシン・デアミナーゼ（以下、ＣＤという）を発現するように形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガムが、酵素−プロドラッグ療法への応用に期待できることが報告されている（例えば、特許文献４及び非特許文献３、４参照）。ＣＤは、抗腫瘍活性を有する５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵという）のプロドラッグ（前駆体）である５−フルオロシトシン（以下、５−ＦＣという）を５−ＦＵに変換する酵素である。
【０００５】
このような形質転換菌の作製には発現ベクターが必要である。しかし、従来から遺伝子工学分野において大腸菌の形質転換に用いられている大腸菌由来のプラスミドベクターは、当然大腸菌以外の菌では複製されないことから、当該形質転換菌の作製においては、当該形質転換菌で複製されるようなプラスミドベクターに改変することが必要となる。
【０００６】
上記文献には、このような、悪性腫瘍治療用形質転換菌の作製に用いられる発現ベクターについても報告されており、特許文献１〜３には、大腸菌とクロストリジウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＮＴＲ５００ＦやｐＣＤ５４０ＦＴ等が報告されている。
また、特許文献４には、大腸菌とビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ、および該シャトルプラスミドの構築に用いられたシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００が報告されている。
【０００７】
その外にも、前記シャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤと比較して１００倍を超える高効率で、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換しうるシャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤが報告されている（例えば、特許文献５参照）。
【０００８】
さらに、当該シャトルプラスミドｐＡＶ００１に組み込まれた目的遺伝子のＤＮＡを一部変異化した、シャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体のシャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８が報告されている（例えば、特許文献６参照）。
【０００９】
その外にも、例えば、大腸菌とビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＤＧ７、大腸菌とクロストリジウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＥＢＭ３およびｐＥＣＭ２、大腸菌とラクトバチルスで相互複製されるシャトルプラスミドｐＬＰ８２５等が報告されている。（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
以上のように、大腸菌以外の形質転換菌の作製に用いられる種々のプラスミドベクターが報告されているが、いずれも大腸菌と大腸菌以外の形質転換菌とで相互複製されるシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌のみで複製されるプラスミドベクターについては未だ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６４１６７５４号公報
【特許文献２】米国特許第６６５２８４９号公報
【特許文献３】米国特許公開２００３／０１０３９５２号公報
【特許文献４】特開２００２−９７１４４号公報
【特許文献５】国際公開 ＷＯ ２００６−５７２８９号公報
【特許文献６】国際公開 ＷＯ ２００７−１３６１０７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)
【非特許文献２】Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)
【非特許文献３】Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002)
【非特許文献４】Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002)
【非特許文献５】Alessandra Argnani et al., Microbiology. ;142: 109-114 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
形質転換遺伝子輸送担体を用いる、固形腫瘍や虚血性疾患等の嫌気的環境下にある疾患（以下、嫌気的疾患という）の治療方法においては、用いる遺伝子輸送担体が非病原性で、且つ、嫌気的状態にある疾患組織等だけにおいて生着、増殖し、嫌気的状態ではない正常な組織では生着、増殖しない偏性嫌気性菌であることが求められる。
さらに、用いる遺伝子輸送担体の形質転換遺伝子が、当該遺伝子輸送担体以外の、病原性菌または好気性若しくは通性嫌気性菌に水平伝達しないこと、さらに、例え水平伝達したとしても、その菌で複製されないことも極めて重要である。そのために、当該形質転換遺伝子輸送担体の作製に用いられる発現ベクターは、当該形質転換菌だけで複製され、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌では複製されないものが望ましい。
【００１４】
これまでに報告されている発現ベクターは、殆どが形質転換菌と当該形質転換菌以外の菌、例えば大腸菌とで相互複製するシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌だけで複製される発現ベクターではない。
本発明の課題は、大腸菌以外の形質転換菌のみで複製され、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌では複製されない発現ベクターを提供することにある。
また、本発明の他の課題は、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該形質転換菌を含有する嫌気的疾患治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、先に、目的遺伝子として、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の中のＣＤを発現する遺伝子を選択し、当該目的遺伝子を組みこむプラスミドベクターとして、当該ＣＤを発現する遺伝子を保有している大腸菌のプラスミドとビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラスミドとを融合したシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを作製し、これを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤが悪性腫瘍の治療に有用な遺伝子輸送担体として期待できることを見出し、報告した（特許文献４）。
【００１６】
本発明者らは、さらに、上記融合プラスミドに改良を加えるべく、組み込まれた目的遺伝子のＤＮＡを一部変異化させて、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体のプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を作製し、これを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８及びその作製方法を報告した（特許文献６）。
これらのプラスミドは何れも、ビフィドバクテリウムと大腸菌とで相互複製されるシャトルプラスミドであることから、何らかの要因により大腸菌へ水平伝達を起こした場合には、当該大腸菌で複製されるものであった。
【００１７】
そこで、本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、上記プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８から、大腸菌の複製開始点を含む断片のｐＵＣ ｏｒｉを取り除いたプラスミドｐＢｉｆｉＣＤを作製し、本プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（タカラバイオ株式会社）を、熱ショック法により形質転換を行ったところ、本願発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤによって大腸菌が形質転換されず、水平伝達のおそれがない事が確認された。
【００１８】
そして、本プラスミドで形質転換した菌、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ、〒２９２−０８１８千葉県木更津市上総鎌足２−５−８）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）は、良好なＣＤ発現作用を示し、該ＣＤによって抗腫瘍物質の５−ＦＵに変換されるプロドラッグの５−ＦＣを併用する事により、極めて顕著な腫瘍増殖抑制効果を発揮し、極めて優れた固形腫瘍治療剤として期待できるものである。
しかも、驚くべき事に、プラスミド保持安定性が高く、さらに、大腸菌の複製開始点を含まないことから、万一、大腸菌への水平伝達を起こしたとしても、大腸菌で複製される可能性がなく、極めて安全で、且つ、高品質の遺伝子輸送担体として期待できることを見出し、本発明を成した。
【００１９】
すなわち本発明は、
［１］嫌気性微生物で機能するプラスミドベクターであって、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクター、
［２］嫌気性微生物が、大腸菌以外の腸内細菌である［１］記載の発現ベクター、
［３］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる一種である［２］記載の発現ベクター、
【００２０】
［４］（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の発現ベクター、
［５］大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種で機能するプラスミド複製ユニットである、［４］記載の発現ベクター、
【００２１】
［６］大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットである、［５］記載の発現ベクター、
［７］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが、ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットである、［６］記載の発現ベクター、
［８］ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットをコードする遺伝子が、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、［７］記載の発現ベクター、
【００２２】
［９］嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種で機能するプロモーターおよびターミネーターである、［４］〜［８］のいずれかに記載の発現ベクター、
［１０］嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターおよびターミネーターである、［９］記載の発現ベクター、
【００２３】
［１１］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターである、［１０］記載の発現ベクター、
［１２］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターである、［１１］記載の発現ベクター、
【００２４】
［１３］ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターをコードする遺伝子が、配列番号４の７番目から３６７番目および１６７６番目から１７８９番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形である、［１２］記載の発現ベクター、
［１４］目的とする活性を有する蛋白質が、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質である、［４］〜［１３］記載の発現ベクター、
［１５］嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［１４］記載の発現ベクター、
【００２５】
［１６］嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［１５］記載の発現ベクター、
［１７］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選ばれる一種である、［１６］記載の発現ベクター、
［１８］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、［１７］記載の発現ベクター、
【００２６】
［１９］シトシン・デアミナーゼをコードする遺伝子が、配列番号４の３９５番目から１６７５番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、［１８］記載の発現ベクター、
［２０］さらに、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットを含み、選択マーカー活性が、薬剤耐性、栄養要求性および培地選択性からなる群より選ばれる１種である、［４］〜［１９］のいずれかに記載の発現ベクター、
［２１］選択マーカー活性が、スペクチノマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性およびカナマイシン耐性からなる群より選ばれる１種の薬剤耐性である、［２０］に記載の発現ベクター、［２２］選択マーカー活性が、スペクチノマイシン耐性である、［２１］記載の発現ベクター、
【００２７】
［２３］選択マーカー活性を発揮する蛋白質をコードするＤＮＡが、スペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡである、［２２］記載の発現ベクター、
［２４］スペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとそのプロモーター配列とを含むＤＮＡが、配列番号４の３３９８番目から４４７６番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形である、［２３］記載の発現ベクター、および、
［２５］配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ配列を含む、［２４］記載の発現ベクター（ｐＢｉｆｉＣＤ）に関する。
【００２８】
また本発明は、
［２６］（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを含む、大腸菌と大腸菌以外の宿主菌で相互複製されるシャトルプラスミドを作製し、該シャトルプラスミドから、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去することを特徴とする、発現ベクターの作製方法に関する。
【００２９】
さらに本発明は、
［２７］［１］〜［２５］のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、
［２８］嫌気性微生物が、大腸菌以外の腸内細菌である、［２７］記載の遺伝子輸送担体、
［２９］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種である、［２８］記載の遺伝子輸送担体、
［３０］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌である、［２９］記載の遺伝子輸送担体、
【００３０】
［３１］ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムからなる群より選ばれる１種である、［３０］記載の遺伝子輸送担体、
［３２］ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、［３１］記載の遺伝子輸送担体、
【００３１】
［３３］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質を発現することができる、［２７］〜［３２］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体、
［３４］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［３３］記載の遺伝子輸送担体、
［３５］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［３４］記載の遺伝子輸送担体、
【００３２】
［３６］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選ばれる一種である、［３５］に記載の遺伝子輸送担体、
［３７］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、［３６］に記載の遺伝子輸送担体、
および、
［３８］遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）である、［３７］に記載の遺伝子輸送担体に関する。
【００３３】
さらに本発明は、
［３９］［２７］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、
［４０］［３４］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質によって抗腫瘍物質に変換される抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる医薬組成物、および、
［４１］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼであり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、［４０］に記載の医薬組成物に関する。
【００３４】
さらにまた本発明は、
［４２］有効治療量の抗腫瘍活性を有する蛋白質を発現するに十分な量の、［３４］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する固形腫瘍治療剤、
［４３］抗腫瘍物質前駆体から有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現するに十分な量の、［３４］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる前記蛋白質によって変換され、かつ、有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる、固形腫瘍治療剤、および、
［４４］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシン・デアミナーゼであり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、［４３］に記載の固形腫瘍治療剤に関する。
【００３５】
なお、本願明細書においては、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、や（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、以下、「目的蛋白質をコードするＤＮＡ」という場合もある。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の発現ベクターは、形質転換菌以外の菌、特に、大腸菌で機能する複製開始点を含まず、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌で複製されるおそれがない、極めて安全なベクターである。
そして、本発明の発現ベクターを用いて形質転換した遺伝子輸送担体は、プラスミド保持安定性が高く、しかも上記のとおり、形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば、大腸菌への水平伝達を起こしたとしても、当該菌で複製されるおそれがない。従って、極めて安全で、高品質の遺伝子輸送担体として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】選択マーカープラスミド（ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の構築工程（工程１）を示す図である。
【図２】選択マーカー・活性蛋白質プラスミド（ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の構築工程（工程２）を示す図である。
【図３】シャトルプラスミド（ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ）の構築工程（工程３）を示す図である。
【図４】プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」の構築工程（工程４）を示す図である。
【図５】B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株の抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の発現ベクターは、嫌気性菌、特に、大腸菌以外の腸内細菌、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、クロストリジウム属細菌等で機能するプラスミドベクターであって、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを具有しない発現ベクターである。
より具体的には、例えば、（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットと、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットからなり、且つ、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクターである。
【００３９】
これまでに報告されているプラスミドベクターは、殆どが遺伝子導入技術情報の豊富さや導入の確実さなどから、大腸菌由来のプラスミドと形質転換菌由来のプラスミドを融合したものである。そして、大腸菌と形質転換菌との双方で機能するシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌のみで機能する発現ベクターではない。
本発明の発現ベクターは、例えば、（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットから本質的になり、且つ、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない点に特徴を有するものである。
【００４０】
本発明の発現ベクターが具有する、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットとしては、大腸菌以外の嫌気性微生物、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌またはクロストリジウム属細菌等の腸内細菌で機能し、形質転換菌以外の嫌気性微生物で機能しないプラスミド複製ユニットであればいかなるものでもよく、大腸菌以外の嫌気性微生物、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが挙げられる。具体的には、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニット又はその一塩基変異多形を例示することができ、より具体的には、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
【００４１】
また、本発明の発現ベクターが具有する、蛋白質発現ユニットのプロモーター及びターミネーターとしては、嫌気性微生物、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌またはクロストリジウム属細菌等の腸内細菌で機能するプロモーター及びターミネーターであればいかなるものでもよく、例えば、嫌気性微生物で機能するヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーター、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができ、具体的には、それぞれ配列番号４の７番目から３６７番目および１６７６番目から１７８６番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
【００４２】
さらに、本発明の発現ベクターは、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットをさらに含んでよい。本発明の発現ベクターが具有する選択マーカー活性としては、本発明のプラスミドベクターで形質転換された嫌気性微生物を選別できるものであれば特に制限されず、例えば、スペクチノマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性、カナマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーや、栄養要求性などが挙げられ、スペクチノマイシン耐性が好ましい。
【００４３】
そして選択マーカー活性遺伝子ユニットとしては、例えば、スペクチノマイシン耐性活性を発揮する蛋白質をコードするＤＮＡの一塩基変異体とそのプロモーター配列とを含むＤＮＡ、例えば、エンテロコッカス・フェカリス由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（以下、ＡＡＤ９カセットという）又はその一塩基変異多形を例示することができ、具体的には、配列番号４の３３９８番目から４４７６番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
なお、本発明で言う一塩基変異体とは、少なくとも１箇所の塩基が変異した一塩基変異多形（以下、ＳＮＰという）を意味し、１箇所のみでのＳＮＰだけでなく、複数個所でのＳＮＰを含む。
【００４４】
本発明の発現ベクターが具有する蛋白質発現ユニットに組み込まれる遺伝子は、例えば、本発明の嫌気的疾患治療剤を悪性腫瘍治療剤として用いる場合は、抗腫瘍活性を有する蛋白質あるいは抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質等を発現する遺伝子であって、巨大サイズＤＮＡ（約１０ｋｂ以上）や受容細胞に有毒となるＤＮＡなど形質転換を阻害するＤＮＡでなければ、いかなるものであってもよい。
【００４５】
当該遺伝子が発現する抗腫瘍活性を有する蛋白質は、例えばサイトカインを含み、具体的なサイトカインとしては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、１β、２、３、４、６、７、１０、１２、１３、１５、１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リンホトキシン（ＬＴ）−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、Ｔ細胞活性化共刺激因子Ｂ７（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）、キット・リガンド、オンコスタチンＭ等が挙げられる。また、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル−１、２、３、４、５等の血管新生抑制物質も挙げられる。
これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてＰＣＲ法等の公知の手法を利用することにより、本発明に用いる抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを入手することができる。
【００４６】
また、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質としては、５−フルオロシトシン（以下、５−ＦＣという）を抗腫瘍活性物質の５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵという）に変換する酵素のシトシン・デアミナーゼ（以下、ＣＤという）や、５−アジリジノ−２，４−ジニトロベンズアミド（以下、ＣＢ１９４５という）を抗腫瘍活性アルキル化剤に変換する酵素のニトロリダクターゼや、ガンシクロビルを抗腫瘍活性代謝物に変換する酵素の単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（以下、ＨＳＶ１−ＴＫという）や、グルクロン酸抱合抗腫瘍活性物質を抗腫瘍活性物質に変換する酵素のβ−グルクロニダーゼなどを挙げることができる。好ましくは、５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素のＣＤを挙げることができる。
【００４７】
ＣＤをコードするＤＮＡは、例えば、大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＡｄｅｘ １ ＣＳＣＤ（理化学研究所 ジーンバンク ＲＤＢ Ｎｏ．１５９１）、又は同じく大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＫ１１６から単離されるものであってよい（D.A.Mead et al.,Protein Engineering 1:67-74(1986)）。
大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４の３９５番目から１６７５番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
【００４８】
さらに、本発明の嫌気的疾患治療剤を虚血性疾患治療剤として用いる場合は、本発明の発現ベクターが具有する蛋白質発現ユニットに組み込まれる遺伝子として、虚血性疾患治療に有用な血管新生促進活性を有する蛋白質も挙げることができる。具体的には、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを挙げることができる。
同様に、これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてＰＣＲ法等の公知の手法を利用することにより、本発明に用いる血管新生促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを入手することができる。
【００４９】
本発明のベクターは、例えば、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよび嫌気性微生物で機能するプロモーター並びにターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットと、選択マーカー活性遺伝子ユニットからなり、嫌気性微生物に形質転換した場合にその嫌気性微生物内において機能するもので、形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まないプラスミドであればいかなるものも含まれる。
【００５０】
例えば、上記文献に報告されている、シャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４）、ｐＡＶ００１（特許文献５）、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１（Tanaka et al., 2005, Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425）、ｐＤＧ７、ｐＥＢＭ３、ｐＥＣＭ２、ｐＬＰ８２５など（非特許文献５）に、目的とする活性を有する任意の蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを組み込み、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去したものなどを挙げることができる。
【００５１】
あるいは、ｐＮＴＲ５００Ｆ、ｐＣＤ５４０ＦＴなど（特許文献１〜３）、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅ−ＣＤ（特許文献５）ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献６）など若しくは、当該プラスミドに組み込まれた蛋白質発現ユニットを、別の、任意の蛋白質発現ユニットに組換え、さらに、それから大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去したものなどを挙げることができる。
【００５２】
本発明の発現ベクターの具体的な例示として、例えば、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットとして、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットを具有し、嫌気性微生物で機能するプロモーター並びにターミネーターを含むＤＮＡ断片として、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを具有し、目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとして、５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素のＣＤをコードするＤＮＡを具有し、選択マーカー活性遺伝子ユニットとして、エンテロコッカス・フェカリス由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（ＡＡＤ９カセット）を含むベクターを挙げることができる。
より具体的な例示として、例えば、配列番号４の塩基配列で示される、ｐＢｉｆｉＣＤを挙げることができる。
【００５３】
本発明のベクターは、例えば、以下のようにして作製することができる。
例えば、
（１）大腸菌の複製開始点、例えばｐＵＣ ｏｒｉと選択マーカー活性遺伝子ユニット、例えば、ＡＡＤ９カセットを含むプラスミド（以下、選択マーカープラスミドという）を作製（以下、工程１という）し、
（２）この選択マーカープラスミドの直鎖化プラスミドを調製し、これと、プロモーター及びターミネーター、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質、例えば、ＣＤを含む断片（以下、蛋白質発現ユニットという）をライゲーションして、選択マーカー活性遺伝子ユニットと蛋白質発現ユニットを有するプラスミド（以下、選択マーカー・活性蛋白質プラスミドという）を作製（以下、工程２という）し、
【００５４】
（３）この選択マーカー・活性蛋白質プラスミドの直鎖化プラスミドを調製し、これと、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニット、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットのＤＮＡ断片（以下、プラスミド複製ユニットという）をライゲーションして、大腸菌の複製開始点及び選択マーカー活性遺伝子ユニット、蛋白質発現ユニット並びにプラスミド複製ユニットを有するプラスミド（以下、シャトルプラスミドという）を作製（以下、工程３という）し、
（４）このシャトルプラスミドから大腸菌の複製開始点を除去（以下、工程４という）することにより作製することができる。
なお、各工程における操作は、文献記載の公知の方法に準じて行うことができる。
【００５５】
ベクターはまた、上記の各種シャトルプラスミド、例えば、シャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４）、ｐＡＶ００１（特許文献５）、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１（Tanaka et al., 2005, Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425）、ｐＤＧ７、ｐＥＢＭ３、ｐＥＣＭ２、ｐＬＰ８２５など（非特許文献５）、ｐＮＴＲ５００Ｆ、ｐＣＤ５４０ＦＴなど（特許文献１〜３）に、常法に従って、目的とする活性を有する任意の蛋白質をコードするＤＮＡならびに該嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを組み込み、次いで、同様に、常法により、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去する事により作製することもできる。
【００５６】
さらに、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献６）から、大腸菌の複製開始点を含む断片のｐＵＣ ｏｒｉを取り除いた、上記本発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤと同様に、本発明のベクターはまた、プラスミドｐＮＴＲ５００Ｆ、同ｐＣＤ５４０ＦＴ（特許文献１〜３）、同ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（特許文献５）などから、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去する事によっても作製することができる。
【００５７】
さらにまた、プラスミドｐＮＴＲ５００Ｆ、ｐＣＤ５４０ＦＴ（特許文献１〜３）、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（特許文献５）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献６）などから、当該プラスミドに組み込まれた蛋白質発現ユニットを、別の、任意の蛋白質発現ユニットに組換え、さらに、それから大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去する事によっても作製することができる。
【００５８】
本発明の嫌気的疾患治療用遺伝子輸送担体は、形質転換する任意の嫌気性微生物を、上記本発明の発現ベクターを用いて、遺伝子工学分野の公知の方法にしたがって形質転換する事により作製することができる。
本発明の発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物は、固形腫瘍等の嫌気的疾患の治療剤に用いるものであるから、当該嫌気性微生物としては、偏性嫌気性で且つ非病原性であることが必須であり、クロストリジウムやサルモネラなどの病原性の菌であっても非病原性化したものであればよく、また、ラクトバチルスなどの通性嫌気性菌であっても偏性嫌気性に変異化したものであればよい。
好ましくは非病原性の嫌気性バクテリアが挙げられ、より好ましくは非病原性の腸内細菌が挙げられ、中でも、ビフィドバクテリウム属細菌が最も好ましい。
【００５９】
ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えばビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが挙げられ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが最も好ましい。
これらの菌は、いずれも市販されているか、又は寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７等は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）から容易に入手することができる。
【００６０】
また、それぞれの菌の株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株が好ましい。
ビフィドバクテリウム・ブレーベの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株が好ましい。
【００６１】
ビフィドバクテリウム・インファンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株が好ましい。
また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２２０）を挙げることができる。
【００６２】
本発明の遺伝子輸送担体は、本発明の発現ベクターで形質転換された上記の嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体であり、嫌気的環境下にある組織内で生育でき、且つ、目的とする活性を有する蛋白質を発現することができ、さらに、形質転換菌以外の、特に病原性又は好気性若しくは通性嫌気性微生物への水平伝達のおそれがほとんどまたは全くないものであれば特に制限されない。
【００６３】
本発明の遺伝子輸送担体の好ましい例示としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる遺伝子輸送担体を挙げることができる。より好ましくは、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素のＣＤを発現することができるビフィドバクテリウム属細菌を含む遺伝子輸送担体を挙げることができる。特に好ましい例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１として２００８年２月１９日付で寄託された、ｐＢｉｆｉＣＤで形質転換されたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株（ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ；ＮＰＭＤ受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−４９１）が挙げられる。
【００６４】
本発明の遺伝子輸送担体の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル（講談社）、高木康敬編遺伝子操作実験法（講談社）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２）、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular C1oning,2nd ed.）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８９）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.），１９４（１９９１）、等に記載された方法に従って行うことができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。また、本発明の嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。
また、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体の２種以上を含有していてもよい。
さらに、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体以外の嫌気的疾患治療効果を示す化合物を含有する医薬組成物や嫌気性疾患治療剤と組み合わせて用いることができる。
【００６６】
また、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の遺伝子輸送担体のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。
【００６７】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の剤型は特に制限されないが、例えば、本発明の遺伝子輸送担体を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の遺伝子輸送担体の嫌気性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプル又はバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥又はＬ乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥又はＬ乾燥した後これをアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射が最も好ましい。
【００６８】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の遺伝子輸送担体の投与量は、疾患部位において生育でき、且つ、有効治療量の活性蛋白質を発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、経済上の観点及び副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。
【００６９】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤における遺伝子輸送担体の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。
例えば、本発明の嫌気的疾患治療剤を固形腫瘍治療剤として用いる際には、用いる嫌気性微生物の菌自体が示す抗腫瘍活性、用いる嫌気性微生物が産生する抗腫瘍活性を有する蛋白質の種類、抗腫瘍物質前駆体から変換される抗腫瘍物質の有効治療量、および用いる嫌気性微生物の当該活性蛋白質の産生量などによって、適宜設定する。
【００７０】
具体的には、例えば静脈内投与の場合には、特に、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、または適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性微生物の菌体を、１日体重１ｋｇ当たり１０６〜１０１２ｃｆｕを１〜複数回に分け、１〜複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明の嫌気性微生物の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、または適当な補液で希釈して、１日１回〜数回に分け、１日〜数日連続して投与する。
【００７１】
また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合は、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性微生物の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０６〜１０１２ｃｆｕを１日１回〜複数回、必要に応じ１日〜複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明の嫌気性微生物の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、好ましくは１日１回〜数回、必要に応じ１〜数日連続して投与する。
治療期間中に疾患組織中の菌が消失していることが確認された場合は、一旦治療を中断し、上記と同様にして菌を投与する。
【００７２】
本発明の遺伝子輸送担体や嫌気的疾患治療剤が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる遺伝子を組み込んだ嫌気性菌の場合、当該遺伝子輸送担体を活性成分として含有する本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤は、当該遺伝子輸送担体によって発現される蛋白質によって有効量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて使用する。この抗腫瘍物質前駆体は本発明の遺伝子輸送担体を活性成分として含有する医薬組成物や固形腫瘍治療剤に含有させてもよいが、当該抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物として、本発明の遺伝子輸送担体を活性成分として含有する医薬組成物や固形腫瘍治療剤と組み合わせて用いることが好ましい。
【００７３】
本発明に用いる抗腫瘍物質前駆体は、前駆体（プロドラッグ）の状態では正常組織に対する副作用が少なく、かつ、抗腫瘍物質に変換後は、治療の対象である各種固形腫瘍に対して高い治療効果を有する抗腫瘍物質前駆体であれば特に制限されないが、例えば前述の、５−ＦＵのプロドラッグである５−ＦＣ、抗腫瘍活性アルキル化剤に変換されるＣＢ１９４５、抗腫瘍活性代謝物に変換されるガンシクロビルやグルクロン酸抱合抗腫瘍活性物質等が挙げられる。
【００７４】
このように、抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤を用いる場合、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与方法と、抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の投与方法は同じであっても異なっていてもよく、また、投与も同時であっても隔時であってもよいが、抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の投与は、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与後、本発明の遺伝子輸送担体が腫瘍細胞で十分生育できる時間をおいた後に投与する方が好ましい。
【００７５】
また、抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤を用いる場合、遺伝子輸送担体が嫌気性環境下にある腫瘍細胞組織でのみ生着・増殖して、そこで局所的に活性蛋白質を産生するため、通常の抗腫瘍物質前駆体を用いる固形腫瘍の治療方法と比較して、副作用をはるかに低減することができ、かつ、抗腫瘍物質前駆体の投与量も広範に設定することができる。
【００７６】
抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の剤型は特に制限されず、通常の、散剤、錠剤、カプセル剤などの経口用剤および、座剤、注射剤などの非経口用剤のいずれであってもよい。このような医薬組成物は、通常の製剤学上の手法にしたがって製造することができる。
抗腫瘍物質前駆体の投与量は、組み合わせて使用する遺伝子輸送担体の腫瘍組織における生育率、及び抗腫瘍物質前駆体から抗腫瘍物質への変換効率に応じて適宜選択することができる。また、遺伝子輸送担体の投与量と同様に、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することもできる。
例えば、実際の治療では、用いる抗腫瘍物質前駆体および変換された抗腫瘍物質の種類、抗腫瘍物質前駆体から変換される抗腫瘍物質の有効治療量、用いる嫌気性微生物が産生する抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の種類、ならびに用いる嫌気性微生物の当該活性蛋白質の産生量などによって、投与量を適宜設定する。
【００７７】
具体的には、例えば、本発明の遺伝子輸送担体の、ＣＤ遺伝子を導入した、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）を活性成分として含有する医薬組成物と抗腫瘍物質前駆体の５−ＦＣを活性成分として含有する医薬組成物を組み合わせて投与する場合には、腫瘍組織中に菌が生着、増殖し、且つ、血液中および正常組織中において菌の消失が確認された後、５−ＦＣを、成人の体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ／日を１日１回〜複数回に分け、治療期間中連続して投与する。投与方法としては、経口投与が好ましいが、静脈内投与あるいは肛門内投与などの非経口投与を行うこともできる。
【００７８】
なお、本発明における「ＸとＹと組み合わせてなる」には、ＸとＹを別の形態としたもの、ＸとＹを同一の形態（例えばＸとＹを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。また、ＸとＹを別の形態としたものの場合、Ｘ、Ｙのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。
【００７９】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、嫌気的環境下にある疾患、好ましくは各種固形癌に適用できる。固形癌としては、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、扁平上皮癌などが挙げられる。
また、嫌気的環境下にある他の疾患としては、虚血性疾患、例えば、心筋梗塞または閉塞性動脈硬化症や、バージャー病などの下肢虚血疾患等を挙げることができる。
【実施例】
【００８０】
以下、参考例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［参考例１］
鋳型ＤＮＡの調製
各実施例において鋳型とする各プラスミドＤＮＡは、０．１×ＴＥを用いて、１０ｐｇ／μＬに濃度を調整し、使用時まで−３０℃の冷凍庫にて冷凍保存した。鋳型とした各プラスミドＤＮＡを以下の表１に示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
［参考例２］
プライマーの調製
ＰＣＲ増幅及び確認用に用いる各プライマーは、０．１×ＴＥにて溶解し１００μＭのストック溶液を調製した。これを０．１×ＴＥにて更にうすめ２０μＭのプライマー溶液を調製した。使用時まで−３０℃の冷凍庫にて冷凍保存した。用いたプライマーを以下の表２に示す。
【００８３】
【表２】
【００８４】
［参考例３］
アガロースゲル電気泳動
以下の各実施例における、アガロースゲル電気泳動は以下のように行った。
サンプルを必要に応じて０．１×ＴＥにて１０倍程度に希釈し、０．８％或いは２％分析用アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド入り）を用いて電気泳動を行った。アガロースゲルの濃度は、サンプルＤＮＡの大きさにより決定した。ＤＮＡの分子量マーカーを別レーンにて同時に電気泳動し、サンプルのＤＮＡサイズを確認した。
また、サンプルの定量が必要な場合は、FastRular DNA Ladder, Low Range (Fermentas)やFastRular DNA Ladder, Middle Range (Fermentas)などの定量マーカーを用いた。定量マーカーの各バンド量は５ｎｇから５０ｎｇ程度とした。
電気泳動後、ゲルにＵＶを照射し、定量マーカーとサンプルとのＤＮＡ濃度を比較し、サンプルのＤＮＡ濃度を見積もった。
【００８５】
［実施例１］
選択マーカープラスミド（ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の作製（工程１）
以下の手順に従って、プラスミドｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉを作製した。
（１）ｐＵＣｏｒｉ断片の調製（約７００ｂｐ）
ｐＵＣｏｒｉのＰＣＲ増幅の条件検討
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋を鋳型に用いて、滅菌済み０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／μＬ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ ５μＬ、５×PrimeSTARＴＭ buffer１０μＬ、ｄＮＴＰ mixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭ ｐＵＣｏｒｉ−Ｆ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ｐＵＣｏｒｉ−Ｒ１プライマー０．５μＬ、PrimeSTARＨＳＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ、および、滅菌精製水２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。
【００８６】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数１】
ＰＣＲ終了後の反応液を１μＬ及び３μＬ用いて、参考例３に示したアガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物の確認を行った。なお、ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
アガロースゲル解析により目的の約７００ｂｐのシングルバンドの増幅が確認され、その収量は約１μｇであった。
【００８７】
追加ＰＣＲ
上記で設定した条件にて５チューブ分の追加ＰＣＲを行い、合わせて約１０μｇのＰＣＲ産物を得た。
精製（タンパク質除去及び濃縮）
上記ＰＣＲ反応液全てをまとめた後、QIAquick PCR purification kit(Qiagen)を用いて精製を行い、常法に従いプライマーおよびタンパク質を除去した。ＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記の精製ＰＣＲ産物を０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、アガロースゲル電気泳動にて定量した。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
【００８８】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＢｇｌＩＩにて以下のように切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＢｇｌＩＩを５５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて２時間保温後、参考例４記載の方法に従ってたんぱく質除去を行った。これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を３０μＬ、ＢｃｕＩを２５５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて３００μＬとした。３７℃にて２時間保温後、QIAquick PCR purification kit(Qiagen)にて精製を行い、５０μＬの０．１×ＴＥにて溶出した。
【００８９】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断後のＰＣＲ産物に１／１０量の１０×loading buffer（タカラバイオ株式会社）を加えよく混ぜ、電気泳動のサンプルとした。２％精製用アガロースゲルを１×ＴＡＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド入）を満たした電気泳動槽（Mupid，コスモバイオ）にセットし、上記電気泳動サンプルをアプライし、５０Ｖにて低温室（４℃設定）で電気泳動を行った。分子量マーカー（FastRular DNA ladder, Low Range, Fermentas）を別レーンにて同時に流した。
ＤＮＡの移動度は、上記アガロースゲルにＵＶハンドモニター（ＵＶＰ）にて３６５ｎｍのＵＶを照射して確認した。電気泳動開始から１３０分後に、約７００ｂｐの目的のバンドが、ゲルの１／２程度の場所に到達した時に電気泳動を終了し、電気泳動槽からゲルを取り出した。
このゲルに３６５ｎｍのＵＶを照射しながら目的のＤＮＡバンドを滅菌したナイフの刃（Sterile Surgical Blades, RuettgersHmbH&Co.KG）にて切り出した。切り出したゲルを細かくスライスし、これを予め重量を測定した滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに入れた。
【００９０】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記切り出しゲルを入れた２ｍＬマイクロチューブの重量を量り、先に量った空チューブ重量を差し引いてゲル重量を算出した。QIAquick Gel Extraction Kitを用いて本キットの製品説明書に従いゲルからＤＮＡを抽出した。最終工程のＤＮＡ溶出は、０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を、０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、精製したＰＣＲ産物を、分光光度計を用いて定量した。また、２％分析用アガロースゲルを用いてアガロースゲル電気泳動を行った。
上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理、アガロースゲルからのＤＮＡ断片切り出し、精製を行った後のＤＮＡ断片について、アガロースゲル解析で、シングルバンドであることを確認した。また、吸光光度計によるＤＮＡ測定により、濃度を測定した結果、濃度は６６ｎｇ／μＬであった。さらに、純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９１１であった。
【００９１】
（２）ＡＡＤ９断片の調製（約１．１ｋｂｐ）
ＡＡＤ９遺伝子のＰＣＲ増幅の条件検討
ｐＢＬＥＳ１００を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／μＬ ｐＢＬＥＳ１００ ５μＬ、５×PrimeSTARＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ） ４μＬ、２０μＭ ＡＡＤ９−Ｆ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＡＡＤ９−Ｒ１プライマー０．５μＬ、PrimeSTARＨＳ ＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。
【００９２】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数２】
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬ 及び３μＬを用いて、アガロースゲル電気泳動法により、ＰＣＲ産物の確認を行った。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
アガロースゲル解析により、目的の約１．１ｋｂｐのシングルバンドの増幅が確認された。また、収量は約１μｇであった。
【００９３】
追加ＰＣＲ
上記と同様にしてチューブ５本分の追加ＰＣＲを行い、合わせて約１０μｇのＰＣＲ産物を得た。
精製（タンパク質除去及び濃縮）
上記、ＰＣＲ反応液全てをまとめた後QIAquick PCR purification kitを用いて精製を行い、常法によりプライマー及びタンパク質を除去した。ＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
この精製ＰＣＲ産物を、０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、これをアガロースゲル電気泳動法にて定量した。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
【００９４】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＢｇｌＩＩにて以下のように切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＢｇｌＩＩを３６ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて２時間保温後タンパク質除去を行った。これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を３０μＬ、ＢｃｕＩを１６５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて３００μＬとした。３７℃にて２時間保温後QIAquick PCR purification kitにて精製を行い、５０μＬの０．１×ＴＥにて溶出した。
【００９５】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したＰＣＲ産物を、上記、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて１３０分間電気泳動を行って分画し、約１．１ｋｂｐの目的のバンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用した。
【００９６】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記切り出しゲルを入れた２ｍＬマイクロチューブの重量を量り、先に量った空チューブ重量を差し引いてゲル重量を算出した。QIAquick Gel Extraction kitを用いて本キットの製品説明書に従いゲルからＤＮＡを抽出した。最終工程のＤＮＡ溶出は、０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を、０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、精製したＰＣＲ産物を、分光光度計を用いて定量した。また、２％分析用アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。
上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理、アガロースゲルからのＤＮＡ断片切り出し、精製を行った後のＤＮＡ断片について、アガロースゲル解析で、シングルバンドを確認した。また、吸光光度計によるＤＮＡ測定により濃度を測定した結果、その濃度は４０ｎｇ／μＬであった。さらに、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９２７であった。
【００９７】
（３）ｐＵＣ ｏｒｉ断片とＡＡＤ ９断片のライゲーション
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、ｐＵＣｏｒｉ精製断片（約７００ｂｐ）とＡＡＤ９精製断片（約１．１ｋｂｐ）をモル比で１：３、重量比では１：５となるように、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＵＣｏｒｉ断片（６６ｎｇ／μＬ）０．７５μＬ（５０ｎｇ）、ＡＡＤ９断片（４０ｎｇ／μＬ）６．２５μＬ（２５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ ８μＬを氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液１）を調製した。
コントロールとして、ＡＡＤ９精製断片のみの反応液（反応液２）を調製した。すなわち、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ＡＡＤ９断片（４０ｎｇ／μＬ）６．２５μＬ（２５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡ理ガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ ８．７５μＬを氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液２）とした。
【００９８】
ＡＡＤ９断片は、プラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４：特開２００２−９７１４４）を鋳型として用いているので、僅かでも混入した場合、後の大腸菌の形質転換工程の後にバックグランドとしてコロニー形成をする。反応液２は、このバックグランド確認用のコントロールとした。
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せ、ライゲーションした。
【数３】
【００９９】
（４）大腸菌の形質転換
上記ライゲーション反応後の溶液を１μＬ使用し、E.coli ＪＭ１０９の形質転換をヒートショックにより行った。形質転換の操作方法は、Takara E.coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ株式会社）の製品説明書に記載の方法に従いった。形質転換後のＳＯＣ懸濁液は、原液及びＳＯＣで１０倍にうすめた希釈液の２種についてそれぞれ１００μＬずつ２枚のＬＢ寒天培地（７５μｇ／ｍＬ ＳＰＣＭ含有）に塗抹した。ライゲーション反応液１及び２を用いて形質転換した大腸菌の塗抹プレートをそれぞれプレート１及び２とした。これらのプレートを３７℃に設定したインキュベータに入れ、１晩培養した。プレート上に形成されたコロニー数を計測した。
精製ｐＵＣｏｒｉ断片と精製ＡＡＤ９断片のライゲーション産物（ライゲーション反応液１）を用いた形質転換では、１０倍希釈菌液１００μＬあたり２８個及び３７個のコロニーが選択培地上に形成されたのに対し、コントロールの反応液２を用いた形質転換ではコロニーは形成されなかった。バックグランドが極めて低く、ライゲーション及び形質転換が良好に行われたことが示唆された。
【０１００】
（５）プラスミドの確認
組換え大腸菌の培養
上記プレート１上のコロニーを無作為に６つ選び、これらを用いて培養を行った。２×ＬＢを滅菌済みの１００ｍＬ容ガラス製三角フラスコに２０ｍＬ入れ、これに７５ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシンを２０μＬ加え、よく混ぜた。各コロニーを、白金耳にて釣菌し、上記の培地にそれぞれ懸濁した。これを３７℃に設定した振とう培養機にセットし、３７℃にて１９．５時間振とう培養した。
【０１０１】
プラスミドＤＮＡの抽出
上記各培養液を２ｍＬの滅菌したマイクロチューブ２本に１．５ｍＬずつ入れた。残りの培養液は、プラスミドの抽出が完了するまでの間氷中に置いた。上記の分注した培養液より、GeneEluteＴＭ Plasmid Miniprep Kitを用いて同キットの製品説明書に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。最終工程のプラスミドＤＮＡの溶出は、５０μＬの０．１×ＴＥを用いた。
【０１０２】
プラスミドＤＮＡの濃度測定
上記で抽出したプラスミドを０．１×ＴＥにて２０倍にうすめ、分光光度計にてＤＮＡ濃度の測定及びＡ２６０／２８０比による品質確認を行った。
組換え大腸菌からのプラスミドＤＮＡ抽出を２回行った結果、ＤＮＡの純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９４４から１．９７２であり、プラスミドＤＮＡの純度は良好であった。また、収量は、２回の抽出物を合わせて、５μｇ以上であった。
【０１０３】
制限酵素による切断
プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを用いて、ＢｃｕＩ単独での切断、ＢｇｌＩＩ単独での切断及びＢｃｕＩとＢｇｌＩＩの両者での切断を行った。反応条件は、酵素の製品説明書に従った。反応容量は２０μＬとした。
６コロニー株の全てについて、ＢｃｕＩ及びＢｇｌＩＩの２種酵素による切断で約７００ｂｐ及び約１．１ｋｂｐの２本のバンドが検出された。
また、ＢｃｕＩ或いはＢｇｌＩＩの単独酵素での切断では約１．８ｋｂｐの１本のバンドが検出された。これより、全株について、プラスミドサイズ、構成がデザインどおりになっている事が示唆された。
【０１０４】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記制限酵素で切断したプラスミドＤＮＡ溶液２０μＬに１０×loading buffer２μＬを加えよく混ぜ、これを常法に従って電気泳動を行った。
上記電気泳動で抽出したプラスミドを用いて、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitにてシーケンス反応を行った。シーケンスプライマーは、下記、表３のプライマーセット１及び２を用いた。
シーケンスのアライメントは、解析ソフトGENETY(R)ATSQ（株式会社ゼネティックス）を使用した。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号１）と比較した。
６株のうち、４株のプラスミド配列はデザインした配列番号１と一致したが、のこり２株のプラスミドには、それぞれ塩基の置換及び欠失があった。
配列番号１と一致した４株の中から１株を選択して、この株より抽出したプラスミドを「ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ」とした。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
［実施例２］
選択マーカー・活性蛋白質プラスミド（ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の構築（工程２）
（１）直鎖化プラスミドｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの調製
プラスミドの切断
ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉを制限酵素ＢｃｕＩ、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにて以下のように切断した。ＸｈｏＩによる切断は、切れ残りプラスミドによる形質転換時のバックグランドを抑える為に行った。
ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ ５μｇに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２５μＬ、ＢｃｕＩを１００ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２５０μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し完全分解されたかどうかを、０．８％分析用アガロースゲルにて確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。切断確認後、酵素反応液よりタンパク質除去を行った。
【０１０７】
これに、１０×バッファＢａｍＨＩ（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢａｍＨＩを８０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにてＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。切断確認後、酵素反応液よりタンパク質除去を行った。
これに１０×Buffer R（酵素添付バッファー）を５０μＬ、ＸｈｏＩを４００ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて５００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、酵素反応液よりタンパク質除去を行った。
【０１０８】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したベクターを、実施例１記載の、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて７５分間電気泳動を行ってＤＮＡを分画し、約１．８ｋｂｐの目的バンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用した。分子量マーカーは、FastRular DNA ladder, Middle Range（Fermentas）を用いた。
【０１０９】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったベクターの一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。また、０．８％分析用アガロースゲルを用いて調製ベクターが約１．８ｋｂｐのシングルバンドであるか否かを確認した。
プラスミドｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの制限酵素処理、アガロースゲルからのＤＮＡ断片切り出し、精製を行った後のＤＮＡ断片について、アガロースゲル解析を行い、約１．８ｋｂｐのシングルバンドを確認した。吸光光度計でのＤＮＡ測定では、濃度が２１ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、２．０４９であった。
【０１１０】
（２）インサート（ＨＵ−ｅＣＤ断片）の調製
プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献５：ＷＯ２００７／１３６１０７）より、ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（ビフィズス菌のＨＵタンパク質のＮ末端９アミノ酸と大腸菌由来のＣＤが融合した蛋白で、基質５−ＦＣとの親和性を高める変異が導入されている）、ＨＵプロモーター、ＨＵターミネーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
以下のように２段階のＰＣＲ（１ｓｔＰＣＲ及び２ｎｄＰＣＲ）を行い、ＨＵ−ｅＣＤ断片を調製した。
【０１１１】
１ｓｔＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
２種類の断片（ＨＵ−ｅＣＤ断片１及びＨＵ−ｅＣＤ断片２）のＰＣＲ増幅条件を検討した。
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８ ５μＬ、５×PrimeSTARＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭｈ）４μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｆ３プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤinnerＲ１プライマー０．５μＬ、PrimeSTARＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、氷上にてＰＣＲ混合液（ＨＵ−ｅＣＤ断片１）を調製した。同様にして、この混合液を３チューブ調製した。
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数４】
【０１１２】
同様にして、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤinnerＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｒ１プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、氷上にてＰＣＲ混合液（ＨＵ−ｅＣＤ断片２）を調製した。同様にして、この混合液を８チューブ調製した。
同様に、サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数５】
【０１１３】
ＰＣＲ終了後、各反応液を１本のチューブにまとめた。
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬ及び３μＬを用いてＰＣＲ産物の確認を行った。ＨＵ−ｅＣＤ断片１及び２の確認には、それぞれ０．８％分析用アガロースゲル及び２％分析用アガロースゲルを用いた。
ＨＵｅＣＤ断片１のＰＣＲ産物をアガロースゲル解析した結果、目的の約１．７ｋｂｐのシングルバンドの増幅を確認した。その収量は４．５μｇ以上であった。
また、ＨＵｅＣＤ断片２のＰＣＲ産物のアガロースゲル解析では、目的の約１５０ｂｐのシングルバンドの増幅が確認され、その収量は約８μｇであった。
【０１１４】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、QIAquick PCR purification kitの使用手順書に従って精製し、プライマーを除去した。精製の最終工程のＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる分画と切り出し
上記の精製ＰＣＲ産物を、上記、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画した。ＨＵ−ｅＣＤ断片１は、０．８％精製用アガロースゲルにて６５分間電気泳動を行い、約１．７ｋｂｐの目的バンドを切り出した。ＨＵ−ｅＣＤ断片２では、２％精製用アガロースゲルにて６５分間電気泳動を行い、約１５０ｂｐの目的バンドを切り出した。
【０１１５】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記、「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
精製ＰＣＲ産物の定量
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を用いて、０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、これを分光光度計にて定量した。ＨＵ−ｅＣＤ断片１及びＨＵ−ｅＣＤ断片２の濃度はともに４７ｎｇ／μＬ、収量が約２．３μｇであった。
【０１１６】
２ｎｄＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
上記のＨＵ−ｅＣＤ精製断片１及びＨＵ−ｅＣＤ精製断片２を鋳型に用いてこれらを連結させるＰＣＲ条件の検討を行った。
鋳型の調製
ＨＵ−ｅＣＤ精製断片１（約１．７ｋｂｐ）５１７ｎｇとＨＵ−ｅＣＤ精製断片２（約１５０ｂｐ）４７ｎｇを混ぜ、０．１×ＴＥにて１ｎｇ／μＬの濃度に調整した。両断片のモル比は１：１となる。
プライマー混合液の調製
２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｆ３プライマーと２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｒ１プライマーを１０μＬずつ等量混ぜた。
【０１１７】
ＰＣＲ混合液の調製
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１ｎｇ／μＬ Ｈｕ−ｅＣＤ断片１および２ミックス１μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ３２．５μＬを加え、氷上にて混合操作を行い、ＰＣＲ反応液を調製した、同様にして、この反応液を３本調製した。
【０１１８】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、９８℃で１０秒、７２℃で１００秒のサイクルを５サイクル行った後に、７２℃にて上記で調製したプライマー混合液を２μＬ添加混合し、サーマルサイクラーにて下記の反応を行った。反応終了後３本のＰＣＲチューブ内の反応液を１本のチューブにまとめた。
【数６】
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬ及び３μＬを、０．８％分析用アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド）を用いて電気泳動を行った。
２ｎｄＰＣＲ断片のアガロースゲル解析により目的の約１．８ｋｂｐのシングルバンドの増幅が確認された。その収量は約１３μｇであった。
【０１１９】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、QIAquick PCR purification kitの使用手順書に従って精製を行いプライマーを除去した。精製最終工程のＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記のプライマー除去したＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて５０倍に希釈し、これを分光光度計により定量した。
【０１２０】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＢａｍＨＩにて切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２５μＬ、ＢｃｕＩを１００ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２５０μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにて、ＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。電気泳動による確認の後、この酵素反応溶液よりタンパク質除去を行った。
これに、１０×バッファＢａｍＨＩ（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢａｍＨＩを８０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにてＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。電気泳動による確認の後、この酵素反応溶液をQIAquick PCR purification kitにて精製した。
【０１２１】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したＰＣＲ産物を、上記、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画し、目的の約１．８ｋｂｐバンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用し、電気泳動開始から７５分後に、約１．８ｋｂｐの目的のバンドが、ゲルの１／３程度の場所に到達した時に電気泳動を終了した。ＤＮＡ分子量マーカーには、FastRular DNA ladder, Middle Range（Fermentas）を用いた。
【０１２２】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記、「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。また、０．８％分析用アガロースゲルを用いて電気泳動による確認をした。
上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理及びアガロースゲル精製後、吸光光度計で測定した結果、ＤＮＡ濃度は４１ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９３２であった。さらに、アガロースゲルでの電気泳動解析でも約１．８ｋｂｐのシングルバンドが認められた。
【０１２３】
（３）直鎖化ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉとＨＵ−ｅＣＤ断片のライゲーション
以下のようにして、ライゲーション反応液（反応液１）およびコントロール反応液（反応液２および反応液３）を調製した。
反応液１
０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、直鎖化ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（約１．８ｋｂｐ）とＨＵ−ｅＣＤ断片（約１．８ｋｂｐ）をモル比で１：３（重量比でも１：３となる）になるように、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（２１ｎｇ／μＬ）２．４μＬ（５０ｎｇ）、ＨＵ−ｅＣＤ断片（４１ｎｇ／μＬ）３．７μＬ（１５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ ８．９μＬを加え、氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液１）を調製した。
【０１２４】
反応液２
同様に、０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（２１ｎｇ／μＬ）２．４μＬ（５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ １２．６μＬを加え、氷上にて加え混和し、ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉのみの反応液（反応液２）を調製した。
【０１２５】
反応液３
同様に、０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ＨＵ−ｅＣＤ断片（４１ｎｇ／μＬ）３．７μＬ（１５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ １１．３μＬを加え、氷上にて加え混和し、ＨＵ−ｅＣＤ断片のみの反応液（反応液３）を調製した。
【０１２６】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数７】
なお、反応液２及び反応液３により、切れ残りプラスミドに由来するバックグランドの割合を見積もった。
【０１２７】
（４）大腸菌の形質転換
上記ライゲーション反応後の溶液を１μＬ使用し、E.coli ＪＭ１０９の形質転換を、実施例１記載の「大腸菌の形質転換」と同様の方法で行った。
ベクターとインサートのライゲーション産物（ライゲーション反応液１）を用いた形質転換では、１０倍希釈菌液１００μＬあたり３４個及び３８個のコロニーが選択培地上に形成されたのに対し、ベクターのみをライゲーションしたコントロール反応液２及びインサートのみをライゲーションしたコントロール反応液３を用いた形質転換ではコロニーは０から１個であった。バックグランドが極めて低く、ライゲーション及び形質転換が良好に行われたことが示唆された。
【０１２８】
（５）プラスミドの確認
組換え大腸菌の培養
実施例１記載の「組換え大腸菌の培養」項に記載した方法に準じて行った。ただし、培養は２０．５時間行った。
プラスミドＤＮＡの抽出
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの抽出」項に記載した方法に準じて行った。
【０１２９】
プラスミドＤＮＡの濃度測定
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの濃度測定」項に記載した方法に準じて行った。
クローニングした全６株の組換え大腸菌からの抽出ＤＮＡの濃度を測定した結果、ＤＮＡの純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９０４から１．９１６であり、プラスミドＤＮＡの純度は良好であった。また、収量は５μｇ以上であった。
制限酵素による切断
プラスミドＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ＢｃｕＩ単独での切断、ＢａｍＨＩ単独での切断及びＢｃｕＩとＢａｍＨＩの両者での切断を行った。反応条件は、酵素の製品説明書に従った。反応容量は２０μＬとした。
【０１３０】
アガロースゲル電気泳動
分析用アガロースゲルは０．８％を用いて、アガロースゲル電気泳動を行った。
クローニング株６つ全てについて、ＢｃｕＩ及びＢａｍＨＩの２種酵素による切断で約１．８ｋｂｐの１本のバンドが検出された。また、ＢｃｕＩ或いはＢａｍＨＩの単独酵素での切断では約３．６ｋｂｐの１本のバンドが検出された。これより、全クローニング株について、プラスミドサイズ、構成がデザインどおりになっている事が示唆された。
【０１３１】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記で抽出のプラスミドを用いて、実施例１記載の「プラスミドのＤＮＡ配列確認」項と同様の方法にて配列決定を行った。プライマーには、実施例１記載の表３のプライマーセット１、２及び３を用いた。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号２）と比較した。
クローニング株全６株のプラスミド配列は、全て配列番号２と一致しており、全て目的の株が得られていることが確認された。全クローニング株の中から１株を選択し、この株より抽出したプラスミドを「ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ」とした。
【０１３２】
［実施例３］
シャトルプラスミド（ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ）の作製（工程３）
（１）直鎖化プラスミドｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの調製
プラスミドの切断
ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉを制限酵素ＢｃｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩにて以下のように切断した。ＨｉｎｄＩＩＩでの切断は、後の工程の形質転換時のバックグランドを抑える為に行った。
ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ ５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＳａｌＩを３４ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて６時間保温した後、その５０ｎｇを取り出し完全分解されたかどうかを０．８％分析用アガロースゲルにて確認した。
【０１３３】
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。ＳａｌＩでの切断を確認した後、この酵素反応液をQIAquick PCR purification kitにて精製した。
これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢｃｕＩを５０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、タンパク質を除去した。
これに、１０×Buffer R（酵素添付バッファー）を１０μＬｍ、ＨｉｎｄＩＩＩを２９ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、QIAquick PCR purification kitを用いてＤＮＡ溶液の精製及び濃縮を行った。
【０１３４】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したベクターを、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画し、約３．６ｋｂｐの目的バンドを切り出した。ただし、０．８％精製用アガロースゲルを用いて、５０Ｖにて９０分間電気泳動を行った。分子量マーカーには、Quick-Load 1kbp DNA ladder（NEB）を用いた。
【０１３５】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったベクターの一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
プラスミドｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの制限酵素処理、アガロースゲルでの精製後のＤＮＡ断片の吸光度を測定した結果、濃度は１３ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９６１であった。
【０１３６】
（２）ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子（インサート）の調製
ＰＣＲの鋳型に用いるｐＢＬＥＳ１００では、ＲｅｐＢ遺伝子のＯＲＦのＣ末端領域と推定ｍｅｍｂＢ遺伝子のＯＲＦのＮ末端領域が重複している。ｍｅｍｂＢのＯＲＦが翻訳されないよう、ｍｅｍｂＢの推定されるリボゾーム結合領域及び翻訳開始コドンＡＴＧを別の塩基に変更した。ただし、その際にＲｅｐＢのアミノ酸変更は伴わない設計とした。以下のように２段階のＰＣＲ（１ｓｔＰＣＲおよび２ｎｄＰＣＲ）を行い、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子を調製した。
【０１３７】
１ｓｔＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
２種類の断片（ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１及びＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２）のＰＣＲ増幅条件を検討した。
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１
ｐＢＬＥＳ１００を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＢＬＥＳ１００ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０ μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐinnerＲ１プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。同様にして、この混合液を３本調製した。
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数８】
【０１３８】
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２
同様に、ｐＢＬＥＳ１００を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＢＬＥＳ１００ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐinnerＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＲ１プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。同様にして、この混合液を３本調製した。
【０１３９】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数９】
ＰＣＲ終了後の反応液各１μＬを用いてＰＣＲ産物の確認および収量見積りを行った。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１のＰＣＲ産物をアガロースゲル解析した結果、目的の約１．３ｋｂｐのシングルバンドの増幅を確認した。その収量は約４．５μｇであった。
また、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２のＰＣＲ産物のアガロースゲル解析では、目的の約４００ｂｐのシングルバンドの増幅が確認され、その収量は約４．５μｇであった。
【０１４０】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、定法（QIAquick PCR purification kit使用手順書）に従って精製及び濃縮した。
ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる分画と切り出し
上記の精製、濃縮したＰＣＲ産物を、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画した。ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１では、０．８％精製用アガロースゲルにて８０分間電気泳動を行った。目的の約１．３ｋｂｐのバンドがゲルの１／２程度のところに到達した時に電気泳動を終了した。分子量マーカーには、FastRular DNA ladder, Middle Rangeを用いた。一方ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２では、２％精製用アガロースゲルにて８０分間電気泳動を行った。目的の約４００ｂｐのバンドがゲルの１／２程度のところに到達した時に電気泳動を終了した。分子量マーカーには、FastRular DNA ladder, Low Rangeを用いた。
【０１４１】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
精製ＰＣＲ産物の定量
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて４倍に希釈し、これを分光光度計にて定量した。
上記アガロースゲル精製後のＰＣＲ産物について、吸光光度計で測定を行った結果、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１及びＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２の濃度はそれぞれ３７ｎｇ／μＬ及び６７ｎｇ／μＬであった。
【０１４２】
２ｎｄＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
上記のＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片１及びＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片２を鋳型に用いてこれらを連結させるＰＣＲ条件の検討を行った。
鋳型の調製
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片１（約１．３ｋｂｐ）３２５ｎｇとＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片２（約４００ｂｐ）１００ｎｇを混ぜ、０．１×ＴＥにて１ｎｇ／μＬの濃度に調整した。ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片１とＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片２の混合比は、モル比で１：１になる。
【０１４３】
プライマー混合液の調製
２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＦ１プライマーと２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＲ１プライマーを等量混ぜた。
ＰＣＲ混合液の調製
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１ｎｇ／μＬ ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ １および２ミックス１μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、PrimeStarＨ ＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ３２．５μＬを加え、氷上にて混合操作を行い、反応液を調製した。同様にして、この混合液を３本調製した。
【０１４４】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せた。
９８℃で１０秒、７２℃で７０秒のサイクルを５サイクル行った後に、７２℃にて上記で調製したプライマー混合液を２μＬを添加混合し、サーマルサイクラーにて下記の反応を行った。
【数１０】
ＰＣＲ終了後の反応液０．５μＬ及び１μＬを用いて、０．８％分析用アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド）にて電気泳動を行った。
２ｎｄＰＣＲ断片のアガロースゲル解析により目的の約１．６ｋｂｐのシングルバンドの増幅が確認された。その収量は６μｇ以上であった。
【０１４５】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、QIAquick PCR purification kitの使用手順書に従い精製してプライマーを除去した。精製の最終工程のＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥ ５０μＬを用いた。
上記のプライマー除去したＰＣＲ産物の一部を用いて０．１×ＴＥにて２０倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
【０１４６】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＳａｌＩにて切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＳａｌＩを２５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて６時間保温した後、その５０ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにて、ＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。電気泳動による確認後、QIAquick PCR purification kitを用いてＤＮＡの精製を行った。
これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢｃｕＩを１１０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、タンパク質の除去を行った。
【０１４７】
ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したＰＣＲ産物を、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画し、目的の約１．６ｋｂｐバンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用し、電気泳動開始から９０分後に、約１．６ｋｂｐの目的のバンドが、ゲルの１／３程度の場所に到達した時に電気泳動を終了した。分子量マーカーには、Quick-Load 1kb DNA Ladder（NEB）を用いた。
【０１４８】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
上記制限酵素処理及びアガロースゲル精製後のＰＣＲ産物を吸光光度計で測定した結果、ＤＮＡ濃度は１６ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、２．０４１であった。
【０１４９】
（３）直鎖化ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉとＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子のライゲーション
以下のようにして、ライゲーション反応液（反応液１）およびコントロールの反応液（反応液２および反応液３）を調製した。
反応液１
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、直鎖化ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（約３．６ｋｂｐ）とＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子（約１．６ｋｂｐ）をモル比で１：３（重量比では１：１．３となる）になるように、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（１３ｎｇ／μＬ）３．８μＬ（５０ｎｇ）、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ断片（１６．５ｎｇ／μＬ）３．９μＬ（６５ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ ７．３μＬを氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液１）を調製した。
【０１５０】
反応液２
同様に、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（１３ｎｇ／μＬ）３．８μＬ（５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ １１．２μＬを氷上にて加え混和し、ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉのみの反応液（反応液２）を調製した。
【０１５１】
反応液３
同様に、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ断片（１６．５ｎｇ／μＬ） ３．９μＬ（６５ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ １１．１μＬを氷上にて加え混和し、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子のみの反応液（反応液３）を調製した。
【０１５２】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数１１】
反応液２により、切れ残りプラスミドに由来するバックグランドの割合を、反応液３により鋳型として用いたプラスミドＤＮＡの持込によるバックグランドの割合を見積もった。
【０１５３】
（４）大腸菌の形質転換
上記ライゲーション反応後の溶液を１μＬ使用し、E.coli ＪＭ１０９の形質転換を、実施例１記載の「大腸菌の形質転換」と同様の方法で行った。
ベクターとインサートのライゲーション産物（ライゲーション反応液１）を用いた形質転換では、形質転換後の菌懸濁原液１００μＬあたり２３８個及び２１６個のコロニーが選択培地上に形成されたのに対し、ベクターのみをライゲーションしたコントロール反応液２ではコロニーは検出されず、インサートのみをライゲーションしたコントロール反応液３を用いた形質転換ではコロニー数は８個及び６個であった。バックグランドが極めて低く、ライゲーション及び形質転換が良好に行われたことを示した。
【０１５４】
（５）プラスミドの確認
組換え大腸菌の培養
実施例１記載の「組換え大腸菌の培養」項に記載した方法にて行った。ただし、培養は２２．５時間行った。
プラスミドＤＮＡの抽出
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの抽出」項に記載した方法にて行った。
【０１５５】
プラスミドＤＮＡの濃度測定
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの濃度測定」項に記載した方法にて行った。
ＤＮＡの純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９５１から１．９５８であり、プラスミドＤＮＡの純度は良好であった。また、収量も１０μｇ以上得られた。
制限酵素による切断
プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを用いて、ＢｃｕＩ単独での切断、ＳａｌＩ単独での切断及びＢｃｕＩとＳａｌＩの両者での切断を行った。反応条件は、酵素の製品説明書に従った。反応容量は２０μＬとした。
【０１５６】
アガロースゲル電気泳動
実施例１記載の「アガロースゲル電気泳動」項に記載した方法にて行った。分析用アガロースゲルは０．８％を用いた。
候補株６つ全てについて、ＢｃｕＩ及びＳａｌＩの２種酵素による切断で約３．６ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐの２本のバンドが検出された。また、ＢｃｕＩ或いはＳａｌＩの単独酵素での切断では約５．２ｋｂｐの１本のバンドが検出された。これより、全候補株について、プラスミドサイズ及び構成がデザインどおりになっている事が示唆された。
【０１５７】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記で抽出のプラスミドを用いて、実施例１記載の「プラスミドのＤＮＡ配列確認」項と同様の方法にて配列決定を行った。プライマーには、実施例１記載の表３のプライマーセット１、２、３及び４を用いた。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号３）と比較した。
クローニング株全６株のうち、４株のプラスミド配列は、配列番号３と一致しており、目的の株が得られていることが確認された。残り２株はｐＴＢ６ ｒｅｐ ｕｎｉｔ内に一塩基欠失が見られた。配列番号３と一致した４株のうち１株を選択し、この株より抽出したプラスミドを「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」とした。
【０１５８】
（６）ビフィズス菌の形質転換
コンピテントセルの調製
Bifidobacterium longum Ｒｅ−１０５Ａグリセリンストックを室温にて融解し、よくまぜた。滅菌したガラスの試験管にＩＭＲ調整培地を１０ｍＬ入れ、これに融解菌液を１００μＬ加えよく混ぜた。これを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。
培養液１ｓｔをよく混ぜた後、その１００μＬを量り取り、ＩＭＲ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌し、これを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて１８時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１５９】
５０ｍＬ容の滅菌済みプラスティックチューブ（BD FalconＴＭチューブ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）４本にＩＭＲ調整培地を各３０ｍＬ分注した。これらのチューブを予め３７℃のインキュベータにて温めておき、これに培養液２ｎｄを各１．５ｍＬずつ加えよく混ぜた。キャップを軽く閉め、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて培養した。１時間３５分経過後、濁度（波長６００ｎｍ）０．２１３となった時に培養を終了し、培養液の入ったチューブを氷上に移した。これを、８０００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。クリーンベンチ内にて上清を捨て、菌体の入った各チューブに、予め氷中で冷やしたＰＢＳバッファー各５ｍＬを加え氷中にて穏やかに菌体を懸濁した。菌懸濁液の入ったチューブ４本を１本のチューブに纏め、これを８０００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。クリーンベンチ内で上清を捨て、菌体に予め氷中で冷やしたＫＭＲバッファー３６０μＬを加え再懸濁した。菌懸濁液は、約７２０μＬとなった。これを氷上にて一晩静置し、コンピテントセルとした。この一部を等量のＫＭＲバッファーにて２倍にうすめた菌懸濁液を調製し、これを２倍希釈コンピテントセルとした。
【０１６０】
形質転換
上記コンピテントセル８０μＬを予め氷冷した１．５ｍＬ容の滅菌済みマイクロチューブに入れた。これにｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを５７８ｎｇ（１μＬ）加え、ピペッティングにて穏やかに混ぜた後氷上に５分間置いた。ポジティブコントロールとして、ビフィズス菌B.longum Ｒｅ−１０５Ａで複製する事が実証済みのｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を４９８ｎｇ（２μＬ）を上記と同様の手順にてコンピテントセルと混ぜた。同様に２倍希釈コンピテントセルとｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを５７８ｎｇ（１μＬ）を混ぜた。予め氷冷したキュベット（BM cuvettes, BM Equipment Co., Ltd.）に、上記の各混合液をそれぞれ移した。この時、ＤＮＡを添加していないコンピテンとセルのみも別のキュベットに加えた（ネガティブコントロール）。
エレクトロポレーションシステム（ジーンパルサーＩＩ、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いて形質転換（エレクトロポレーション）を行った。エレクトロポレーターは、ボルテージを２．０ｋＶ、キャパシタを２５μＦ、レジスタを２００Ωに設定し、本システムの取扱い説明書に従って操作した。
【０１６１】
電気ショック後は、キュベットにＩＭＲ液体培地８００μＬとビタミンＣ添加液５０μＬの混合液を即時に加え、これを滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに回収した。各チューブについて同様の操作を行い、これら２ｍＬチューブの蓋を開けてデシケータに入れた。デシケータ内の空気を真空ポンプにて脱気したのち、炭酸ガスを封入した。この操作を３回繰り返してデシケータ内の空気を炭酸ガスに置換した後、デシケータを３７℃に設定したインキュベータに入れ、３時間保温した。
保温後の各菌懸濁液をよく混ぜた後、その１００μＬを量り取り、ＩＭＲ寒天培地（７５μｇ／ｍＬ ＳＰＣＭを含有）２枚にそれぞれ塗抹した。これらのプレートを脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック(R)・ケンキ、三菱ガス化学株式会社）とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベータにて３日間培養した。
【０１６２】
コロニーの培養
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅによる形質転換コロニーを無作為に６個選び、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管にそれぞれ植菌した。コントロールとして、ＡＰＳ００１Ｃマスター・セル・バンクグリセリンストック（２００７．３．２２製造、シリアル番号：００４−０１２７）を室温にて融解し、その１００μＬを用いてＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。これら植菌後の試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。
培養液１ｓｔをよく混ぜた後、その１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。これらを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１６３】
プラスミド抽出
ＡＰＳ００１Ｃを除く上記培養液１ｓｔを２ｍＬ用いて、QIAprep Spin Miniprep Kitにてプラスミド抽出及び精製を行った。詳細は本キットの製品手順書に従った。
【０１６４】
プラスミドの確認（ＰＣＲ）
上記で抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、プラスミドの有無を確認した。滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、プラスミドＤＮＡ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭチェックＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭチェックＲ２プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。
ポジティブコントロールとして、大腸菌より抽出したプラスミドｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを１０ｐｇ／ｍＬの濃度に調製した溶液を鋳型にしたＰＣＲ混合液も同様に調製した。
【０１６５】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数１２】
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬを用いてＰＣＲ産物の確認行った。ゲルは０．８％分析用アガロースゲルを用いた。
【０１６６】
［実施例４］
プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」の構築 （工程４）
（１）ｐＵＣ ｏｒｉ除去断片の調製
プラスミドの制限酵素による切断
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩにて以下のように切断した。
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ １０μｇに、１０×バッファＢａｍＨＩ（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢａｍＨＩを６９ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとしよく混ぜた。３７℃にて３時間１０分保温した後、その５０ ｎｇを取り出し完全分解されたかどうかを、０．８％分析用アガロースゲルにて確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。ＢａｍＨＩでの切断を確認した後、この酵素反応溶液よりタンパク質除去を行った。
【０１６７】
これに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＢｇｌＩＩを４５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとしよく混ぜた。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにて完全分解されたかどうかを確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。
制限酵素で切断したプラスミドＤＮＡ溶液１００ｎｇに０．１×ＴＥを加え全量を１０μＬとし、これに１０×loading buffer１μＬを加えよく混ぜる。これを電気泳動サンプルとする。ゲルは０．８％分析用アガロースゲルを用いた。
【０１６８】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したベクターを、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて１２０分間電気泳動を行い、約４．５ｋｂｐの目的のバンドが、約６５０ｂｐの不要バンドと十分に分離した事を確認した上で、約４．５ｋｂｐのＤＮＡバンドを切り出した。分子量マーカーには、Quick-Load 1kb DNA Ladderを用いた。
【０１６９】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったベクターの一部を０．１×ＴＥにて１５倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
制限酵素によるｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅの切断、アガロースゲルによる精製を行った後、吸光光度計で測定した結果、ＤＮＡ濃度は４７ ｎｇ／μＬで、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９３７であった。
【０１７０】
（２）精製したｐＵＣｏｒｉ除去断片のセルフライゲーション
ライゲーション反応
精製したｐＵＣｏｒｉ除去断片（約４．５ｋｂｐ）のセルフライゲーションを行った。滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＵＣｏｒｉ除去断片（４７ｎｇ／μＬ）１μＬ（４７ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ １４μＬを氷上にて添加混和し、ライゲーション反応液を調製した。この反応液を２０本調製した。
【０１７１】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数１３】
【０１７２】
精製（タンパク質除去及び濃縮）
上記ライゲーション反応液２０本を滅菌マイクロチューブ１本にまとめた後、タンパク質の除去を行った。ただし、ＤＮＡの溶解は、１０μＬの０．１×ＴＥにて行った。
【０１７３】
（３）ビフィズス菌の形質転換
形質転換
Bifidobacterium longum Ｒｅ−１０５Ａコンピテントセルの形質転換（エレクトロポレーション）を、上記精製ライゲーション反応産物５００ｎｇ（５μＬ）を用いて行った。バックグランドコントロールとしてライゲーション反応を行っていないｐＵＣｏｒｉ除去断片５００ｎｇ（１０μＬ）も同様に別チューブにてコンピテントセルと混ぜた。エレクトロポレーション操作は、実施例３記載の「形質転換」と同様の方法にて行った。
【０１７４】
コロニーの培養
精製ライゲーション反応産物にて形質転換を行ったコロニーを無作為に８個選び、実施例３記載の「コロニーの培養」と同様の方法にて培養を行った。
プラスミド抽出
上記培養液１ｓｔを１．５ｍＬ用いて、実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの抽出」と同様の方法にてプラスミド抽出及び精製を行った。
【０１７５】
プラスミドの確認（ＰＣＲ）
上記で抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型に用いて、実施例３記載の「プラスミドの確認」と同様の方法にてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬを用いてＰＣＲ産物の確認を行った。ゲルは０．８％及び２％分析用アガロースゲルの２種類を用いた。
【０１７６】
（４）プラスミドの配列確認
培養
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株のグリセリンストックを融解し、よく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。培養液１ｓｔをよく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管２本にそれぞれ植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１７７】
プラスミド抽出
上記培養液２ｎｄを適量用いて、QIAprep Spin Miniprep Kitにてプラスミド抽出及び精製を以下のように行った。
培養液２ｎｄを２．５ｍＬずつ４本の１５ｍＬ容プラスティックチューブ（BD FalconＴＭ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に入れ、各チューブに３０ｍＭ ＧＴＡバッファを７．５ｍＬ加えた。これを混ぜた後、１２０００ｒｐｍで１５分間２５℃にて遠心分離を行い、その上清をピペッティングにて捨てた。チューブ内の菌体に３０ｍＭ ＧＴＡバッファを１０ｍＬ加え混ぜた後、１２０００ｒｐｍで１５分間２５℃にて遠心分離を行い、その上清をピペットにて捨てた。菌体の入ったチューブ２本分を１本にまとめた後、これにＮ−アセチルムラミディス溶液（生化学工業株式会社製のＮ−アセチルムラミディス凍結乾燥品に、３０ｍＭ ＧＴＡバッファを加え３０００ユニット／ｍＬに調製した）を１ｍＬずつ加えよく混ぜた。このチューブを５０℃に設定したウォーターバスにて３時間保温した後に、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（キアゲン株式会社）を２５０μＬ加えよく混ぜ、６０℃に設定したウォーターバスにて３０分間保温した。ここで２本のチューブを１本にまとめた。
【０１７８】
これに、等量のバッファＰ１（キット添付）を加え混和した（Ａ）。この混和物を４本の１５ｍＬ容プラスティックチューブに分け、これにＡと等量のLysis溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ／２％ＳＤＳ）を加え転倒混和し、続いてＡの１．４倍容量のバッファＮ３（キット添付）を加え転倒混和して、菌体の溶菌、ついで中和を行った。１２０００ｒｐｍにて１５分間２５℃にて遠心分離を行った後、その上清を１５ｍＬ容プラスティックチューブに回収した。この回収液をQIAquick Spin Column（キット添付）８本を使用して精製した。精製方法は、同キットの手順書に従った。最終工程のＤＮＡ溶出は、５０μＬの０．１×ＴＥにて行い、約４００μＬのプラスミド溶液を得た。
【０１７９】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記で抽出したプラスミドを用いて、実施例１記載の「プラスミドのＤＮＡ配列確認」項と同様の方法にて配列決定を行った。プライマーには、実施例１記載の表３のプライマーセット１、３及び４を用いた。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号４）と比較した。
クローニング株より抽出したプラスミドの全長シーケンスを決定した結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤのプラスミド配列は、配列番号４と一致していた。このクローニング株より抽出したプラスミドを「ｐＢｉｆｉＣＤ」とした。
【０１８０】
［試験例１］
ビフィズス菌の形質転換及びその基本特性の確認
（１）B.longum Ｒｅ−１０５Ａの形質転換の確認
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅよりｐＵＣｏｒｉ部分を除去後閉環したセルフライゲーション産物及びｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを用いたB.longum Ｒｅ−１０５Ａの形質転換結果を確認した。
プレート１から５は、同じコンピテントセルを使用した。プラスミドを加えていないネガティブコントロール（プレート番号１）ではコロニー数は１個及び０個であった。
しかし、ビフィズス菌中で複製される事が既に実証されているシャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献５；ＷＯ ２００７−１３６１０７）を用いて形質転換したポジティブコントロール（プレート５）でもコロニー数が５個及び２個であり、ネガティブコントロールとの数の差が小さかった。この事より、プレート１から５に使用したコンピテントセルの形質転換の効率は低いと考えられた。
【０１８１】
一方、プレート６では、コンピテントセル濃度を２倍にうすめたものを使用しており、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅにて形質転換を行った際に、プレート１枚あたり５００個以上のコロニーが形成された。プレート６に対するネガティブコントロールを実施していないが、プレート６上のコロニーがプラスミドｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅにて形質転換されている可能性が高いと考えられた。また、コンピテントセルの濃度が形質転換効率に大きく寄与している事が分かった。
また、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅよりｐＵＣｏｒｉを除去した断片のライゲーションを行った場合と行わなかった場合で、それらでの形質転換結果（それぞれプレート３及び４）は、プレート３で３個及び８個、プレート４で１個及び２個とコロニー数が何れも少なかった。
結果を表４に示した。
【０１８２】
【表４】
【０１８３】
（２）B.longum Ｒｅ−１０５Ａ形質転換体のプラスミド確認
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株８つ及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株６つより抽出したプラスミドを鋳型に用いてチェックプライマーでのＰＣＲを行った結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株では約５００ｂｐの増幅産物が検出された。また、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株では、１．１ｋｂｐの増幅産物が検出された。これよりクローニング株全てがプラスミドを有している事を確認した。また、ｐＢｉｆｉＣＤがｐＵＣｏｒｉ断片を含んでいない事が示された。
【０１８４】
［試験例２］
シトシン・デアミナーゼ活性の確認
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株８株及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株６株を用いてシトシン・デアミナーゼ（ＣＤ）活性の確認を行った。
ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調製培地での培養液２ｎｄ各１ｍＬ用いて、トリスバッファ（ｐＨ８．４）で３回洗浄後、超音波破砕し総タンパク質を抽出した。Ｌｏｗｒｙ法変法にて総タンパク質量を定量し、５μｇの総タンパク質を用いて、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を基質とした酵素反応を行った。酵素反応で生じた５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、残存の５−ＦＣ量を液体クロマトグラフィーにて定量し、ＣＤ酵素活性を算出した。
【０１８５】
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株のＣＤ活性を測定した結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株８株のＣＤ活性は８．０７〜１０．２９（平均：８．７４）ユニット／μｇ総タンパク質で、菌株による差は殆どなかった。
また、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株６株のＣＤ活性は８．１３〜９．６６（平均：８．６９）ユニット／μｇ総タンパク質で、同様に菌株による差は殆どなかった。
両クローニング株のＣＤ活性はほぼ同等であるものの、平均値ではB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株のＣＤ活性が僅かながら強く、ｐＵＣｏｒｉ断片の除去によるＣＤ活性の低下はなく、むしろ良好に作用していることが示唆された。
この試験により、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ及びｐＢｉｆｉＣＤがビフィズス菌中で複製し、充分なＣＤ活性を有する事が実証された。測定結果は、表５に示すとおりである。
【０１８６】
【表５】
【０１８７】
［試験例３］
プラスミド保持安定性の確認
スペクチノマイシン入りの培地での培養で充分に活性化した培養液を、スペクチノマイシン非添加の培地にて培養を行った際のプラスミド保持安定性を以下のように確認した。
【０１８８】
ＳＰＣＭ添加培地での選択培養
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株２株のグリセリンストック及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株１株のグリセリンストックを融解し、よく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。ＡＰＳ００１Ｃ ＭＣＢ（シリアル番号００４−０１１６）についても同様の操作にて植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。培養液１ｓｔをよく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管２本にそれぞれ植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１８９】
ＳＰＣＭ非添加培地での非選択培養
ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ非選択調製培地の入った１０ｍＬ試験管を予め３７℃に設定した水浴中にて温めた後、クリーンベンチ内で、この培地に上記のＳＰＣＭ添加培地での培養液２ｎｄを１０μＬずつ植菌した（０．１％植菌）。植菌後の各試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器にいれ、３７℃に設定したインキュベータに入れた。これら一連の操作は迅速に行い、培地の温度変化を出来るだけ少なくした。これら試験管を２４時間培養した後、各培養液を接種菌液として同様の方法にてＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ非選択調製培地への継代を繰り返した。
ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ非選択調整培地での３回目の継代培養液をよく振り混ぜた後、その１００μＬを量りとり、嫌気性希釈液９．９ｍＬに加えよく混ぜた（１０２倍希釈液）。この１０２倍希釈液を同様の方法にて薄めて１０４倍希釈液、次いで１０６倍希釈液を調製した。この１０６倍希釈液を１００μＬずつＢＬ寒天培地５枚に塗抹した。これらのプレートを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器にいれ、３７℃に設定したインキュベータにて２日間嫌気培養を行った。
【０１９０】
ＢＬ−ｂＳ寒天培地へのレプリカ
上記のＢＬ寒天培地より、よく分離したコロニー３００個を無作為に選別し使用した。滅菌した爪楊枝にてコロニーを釣菌し、ＢＬ−ｂＳ寒天培地、ＢＬ寒天培地の順に植菌した。これを各寒天培地１枚に対し５０個、計６枚に植菌した。植菌後の寒天培地は密閉容器にその容積に応じた脱酸素・炭酸ガス発生剤と共に入れ嫌気状態にし、３７℃で１日間培養した。
【０１９１】
培養終了後の計測は、爪楊枝による穿刺跡に明らかな菌の増殖が見られないものに印をつけ、それ以外の菌の増殖が見られたものをカウントした。プラスミドを保持する菌は、ＳＰＣＭ耐性であるので、プラスミド保持菌率は、ＳＰＣＭ耐性菌率として示される。プラスミド保持菌率を以下の式によって求めた。
【数１４】
【０１９２】
プラスミド保持安定性を測定した結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株＃１及び＃５のスペクチノマイシン耐性菌比率、すなわちプラスミド保持菌比率はともに８７．７％で極めて高い値を示した。
また、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅでは、プラスミド保持菌比率は８０．３％であった。
一方、シャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８で形質転換したB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（ＡＰＳ００１Ｃ：特許文献６；ＷＯ ２００７−１３６１０７）のプラスミド保持菌比率は７１．７％であり、本発明のB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤのプラスミド保持菌比率より大きく下回る結果であった。
【０１９３】
本発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤは、ビフィズス菌B.longum Ｒｅ−１０５Ａ内で安定に保持され、本発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤで形質転換したB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤは極めて高いプラスミドの保持安定性を示すことが確認された。
また、両クローニング株共、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８に比べ、極めて良好なプラスミド保持菌比率を示し、しかも、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株は、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株に比べプラスミド保持菌比率が高く、ｐＵＣｏｒｉ断片の除去により、プラスミド保持菌比率が向上していることが確認された。
測定結果を表６に示した。
【０１９４】
【表６】
【０１９５】
［試験例４］
プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」による大腸菌形質転換可否の確認
本願発明のプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」によって大腸菌が形質転換されない事を、シャトルプラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」を対照に用いて、以下のようにして確認した。
（１）プラスミドの調製
以下に示すようにして、本発明プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」及び対照プラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」を調製した。
【０１９６】
培養
実施例４で作製したプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」による形質転換ビフィズス菌（B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ）をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に１％植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ３７℃て２４時間培養した。これを良く混ぜた後、その１％をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に植菌し同様に２４時間培養した。
同様に、実施例３で作製したシャトルプラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」による形質転換ビフィズス菌（B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ）をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に１％植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ３７℃て２４時間培養した。これを良く混ぜた後、その１％をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に植菌し同様に２４時間培養した。
【０１９７】
プラスミド抽出
上記培養液各２ｍＬを用いて、３０ｍＭ ＧＴＡバッファー（ｐＨ５．５）にて２回洗浄し、Ｎアセチルムラミダーゼ処理次いでプロテイナーゼＫ処理を行なった。これをQIAprep Spin Miniprep Kitにて精製し、それぞれのプラスミドＤＮＡを抽出した結果、それぞれ、約９μｇのプラスミドＤＮＡを得た。
【０１９８】
（２）大腸菌の形質転換
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（タカラバイオ株式会社）（１００μＬ）を上記で調製したプラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」及び「ｐＢｉｆｉＣＤ」を各５０ｎｇ（１μＬ）用いて熱ショック法によりそれぞれ形質転換を行った。形質転換方法は、コンピテントセル付属の製品説明書に従った。
熱ショック次いでＳＯＣ培地添加保温後の菌懸濁液をＬＢ寒天培地（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含む）２枚に１００μＬずつ塗布後、３７℃にて一晩培養した。
【０１９９】
培養後の各プレート上のコロニーの有無を確認した結果、対照プラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」を用いた大腸菌の形質転換でのみコロニーを検出した。
一方、プラスミドの代わりに０．１×ＴＥを混ぜた陰性コントロール及び本発明のプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」では、形質転換後にコロニーが検出されなかった。
本発明のプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」は、例えプラスミドが強制的に大腸菌に導入されたとしても、大腸菌内で複製できない事が確認された。
結果は、表７に示すとおりである。
【０２００】
【表７】
【０２０１】
［試験例５］
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株の抗腫瘍効果の確認
（１）B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株培養生菌（被検薬）の調製
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株のグリセリンストックを常温にて融解し、適量を、炭酸カルシウム添加液体培地を入れた試験管に植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れて、３７℃インキュベータにて２４時間嫌気培養して活性化培養を行った。次いでこの培養液適量を、炭酸カルシウム非添加液体培地を入れた試験管に植菌し、同様の嫌気条件下で１８時間培養した（本培養）。
【０２０２】
培養液を５０ｍＬ容のポリプロピレン製コニカルチューブ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に移し混和し、この培養混合液５ｍＬを４倍量（２０ｍＬ）の冷却（５℃）生理食塩水に加え良く混和したものを３本調製した。 各チューブを８，０００ｒｐｍで１０分間冷却（４℃）遠心し、上清を除去した後、再度冷却生理食塩水２０ｍＬを加えて菌を懸濁することにより洗浄を行った（洗浄操作１）。この洗浄操作を更に２回行い、合計３回の洗浄を行った菌液を１本のチューブにまとめた後、懸濁菌液の容量を６．５ｍＬに調製した。この洗浄菌懸濁液を８μｍのメンブランフィルター（ポリカーボネート、東洋濾紙株式会社、Ｋ８００Ａ０２５Ａ）でろ過し、回収したろ液（培養生菌液）の生菌を被験薬として使用した。
【０２０３】
（２） 移植腫瘍細胞の培養
ヒト乳癌細胞株のＫＰＬ−１細胞は、５６℃で３０分間非動化したＦＢＳ（１０ｖ／ｖ％）及びペニシリン（５００００ Ｕ／ｍＬ）・ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を１ｖ／ｖ％添加したＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
コンフルエントとなった時点で１×ＰＢＳ（−）で洗浄後１×トリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を剥がし、遠心操作（１０００回転／５分間）で回収した細胞を、ＤＭＥＭ培地にて適宜希釈して継代培養した。
移植実験には５回継代後の細胞を用いた。トリパンブルーで染色されない生細胞数をThoma血球計算盤（Thoma deep 0.1 mm ERMA、東京）で計数し、ハンクス液に懸濁して細胞数を２．５×１０６個／ｍＬに調製した。
【０２０４】
（３） 担癌ヌードマウスの作製と腫瘍体積の測定
調製したＫＰＬ−１細胞懸濁液０．２ｍＬをヌードマウスの右前肢背部側の皮下に移植した（５×１０５個／マウス）。
移植後の腫瘍体積は、腫瘍径（長径、短径、厚み）をノギスで測定し、下式により求めた。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×厚み（ｍｍ）／２
【０２０５】
（４） 群分けと培養生菌（被験薬）、糖源（ラクツロース）およびプロドラッグ（５−ＦＣ）の投与
群分けと培養生菌（被験薬）の投与
ＫＰＬ−１担癌ヌードマウスの腫瘍体積が６０〜９５ｍｍ３程度のマウス１６匹を選別して、均等になるように２群（１群８匹）に分け、１群を対照群（無処置群）とし、もう１群を治療群とした。
治療群に、マウスあたり０．３ｍＬの培養生菌（被験薬）を１日に３回（ＡＭ／ＰＭ）、２日間（ｄａｙ１〜２）静脈内投与した。
培養生菌は、総投与容量として１．８ｍＬ、総投与菌数として５．９×１０９ｃｆｕ／マウスを投与した。
投与生菌数は以下のようにして測定した。
【０２０６】
生菌数測定
培養菌液を嫌気性希釈液で１０６倍に希釈し、その１００μＬをＢＬＦＳプレート各３枚に塗布し、密閉容器（アネロパック角型ジャー、三菱ガス化学）内に脱酸素・炭酸ガス発生剤と共に３７℃の恒温器で３日間嫌気培養した。コロニー数が３０〜３００程度検出されるプレートから下式により投与菌数を算出した。
投与菌数（ｃｆｕ）＝コロニー数（ａ）×プレート塗布時の希釈率（ｂ）×製剤１ｍＬ当たりの換算係数（ｃ）×投与量（ｍＬ）
（ａ）：（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）／３〔３プレート（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３）の平均コロニー数〕
（ｂ）：×１０６〔１０６倍希釈〕
（ｃ）：×１０〔１プレートあたり１００μＬを塗布〕
【０２０７】
ラクツロースの投与
治療群にはさらに、菌の糖源として、ラクツロース溶液を以下のように投与した。
２０％（ｗ／ｖ）になるよう精製水で溶解し１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌したラクツロース溶液１ｍＬをマウス腹腔内に１日に１回投与した。
投与期間は培養生菌投与終了翌日から２１日間（Ｄａｙ３〜２３）とした。
【０２０８】
フルシトシン（５−ＦＣ）の投与
５−ＦＣ溶液０．４ｍＬを、１日に３回（およそ９：００、１４：００、１８：００頃）マウスに経口投与した（総投与容量１．２ｍＬ）。
投与期間はＡＰＳ００１Ｆ培養生菌投与終了翌日から２１日間（Ｄａｙ３〜２３）とした。
【０２０９】
（５）腫瘍増殖抑制効果の確認
全てのマウスについて、治療開始前（群別け時）および治療開始後２４日間、３〜４日に１回の頻度で腫瘍径を測定し、腫瘍増殖に対する効果を確認した。
各群のマウスの腫瘍体積の平均値±ＳＤを算出し、対照群に対する相対腫瘍体積比率〔Ｔ／Ｃ（％）〕を指標として抗腫瘍効果を判定した。
対照群及び治療群の腫瘍体積（平均値±ＳＤ）を以下の表８に示す。
またこの時の経日的な腫瘍体積の変動を図５に示す。
試験終了日（ｄａｙ２４）での治療群の相対腫瘍体積比率〔Ｔ／Ｃ（％）〕は２３．０％であり、顕著な腫瘍増殖抑制活性が認められた。
【０２１０】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０２１１】
本発明の課題は、形質転換菌のみで複製され、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌では複製されない発現ベクターおよびその作製方法を提供することにある。また、本発明の課題は、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該形質転換菌を含有する固形腫瘍治療剤を提供することにある。
【０２１２】
本発明のベクターは、形質転換菌以外の菌、特に、大腸菌で機能する複製開始点を含まず、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌で複製されるおそれがない、極めて安全なベクターである。そして、本発明のベクターを用いて形質転換した遺伝子輸送担体は、プラスミド保持安定性が高く、さらに、形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば、大腸菌への水平伝達を起こしたとしても、当該菌で複製されるおそれがなく、従って、極めて安全で、高品質の遺伝子輸送担体として期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気的疾患治療用遺伝子輸送担体として有用な形質転換嫌気性微生物の作製に用いられる発現ベクター及びその作製方法に関する。また、本発明は、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該遺伝子輸送担体を含有する嫌気的疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学分野において、微生物を形質転換するために用いる発現ベクターとしては、ファージ、動植物ウィルス、プラスミドなどが広く用いられている。そして、形質転換して遺伝子産物の目的蛋白質を発現させる形質転換微生物として、大腸菌や酵母などが広く用いられている。これらの形質転換微生物は、目的蛋白質を発現させるためのものであり、微生物そのものを利用するものではない。
【０００３】
近年、形質転換した微生物そのものを利用する方法に関して、悪性腫瘍の治療方法において、形質転換嫌気性菌を遺伝子輸送担体として用いる方法が注目され、例えば、形質転換したクロストリジウムを用いた腫瘍部位への遺伝子輸送方法が提案されており（例えば、特許文献１〜３参照）、さらに、形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガムについて、固形腫瘍に対する治療への応用が示唆されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００４】
また、固形腫瘍治療用の遺伝子輸送担体として有用な形質転換ビフィズス菌に関して、シトシン・デアミナーゼ（以下、ＣＤという）を発現するように形質転換したビフィドバクテリウム・ロンガムが、酵素−プロドラッグ療法への応用に期待できることが報告されている（例えば、特許文献４及び非特許文献３、４参照）。ＣＤは、抗腫瘍活性を有する５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵという）のプロドラッグ（前駆体）である５−フルオロシトシン（以下、５−ＦＣという）を５−ＦＵに変換する酵素である。
【０００５】
このような形質転換菌の作製には発現ベクターが必要である。しかし、従来から遺伝子工学分野において大腸菌の形質転換に用いられている大腸菌由来のプラスミドベクターは、当然大腸菌以外の菌では複製されないことから、当該形質転換菌の作製においては、当該形質転換菌で複製されるようなプラスミドベクターに改変することが必要となる。
【０００６】
上記文献には、このような、悪性腫瘍治療用形質転換菌の作製に用いられる発現ベクターについても報告されており、特許文献１〜３には、大腸菌とクロストリジウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＮＴＲ５００ＦやｐＣＤ５４０ＦＴ等が報告されている。
また、特許文献４には、大腸菌とビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ、および該シャトルプラスミドの構築に用いられたシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００が報告されている。
【０００７】
その外にも、前記シャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤと比較して１００倍を超える高効率で、ビフィドバクテリウム・ロンガムを形質転換しうるシャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤが報告されている（例えば、特許文献５参照）。
【０００８】
さらに、当該シャトルプラスミドｐＡＶ００１に組み込まれた目的遺伝子のＤＮＡを一部変異化した、シャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体のシャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８が報告されている（例えば、特許文献６参照）。
【０００９】
その外にも、例えば、大腸菌とビフィドバクテリウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＤＧ７、大腸菌とクロストリジウムで相互複製されるシャトルプラスミドｐＥＢＭ３およびｐＥＣＭ２、大腸菌とラクトバチルスで相互複製されるシャトルプラスミドｐＬＰ８２５等が報告されている。（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
以上のように、大腸菌以外の形質転換菌の作製に用いられる種々のプラスミドベクターが報告されているが、いずれも大腸菌と大腸菌以外の形質転換菌とで相互複製されるシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌のみで複製されるプラスミドベクターについては未だ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６４１６７５４号公報
【特許文献２】米国特許第６６５２８４９号公報
【特許文献３】米国特許公開２００３／０１０３９５２号公報
【特許文献４】特開２００２−９７１４４号公報
【特許文献５】国際公開 ＷＯ ２００６−５７２８９号公報
【特許文献６】国際公開 ＷＯ ２００７−１３６１０７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)
【非特許文献２】Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)
【非特許文献３】Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002)
【非特許文献４】Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002)
【非特許文献５】Alessandra Argnani et al., Microbiology. ;142: 109-114 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
形質転換遺伝子輸送担体を用いる、固形腫瘍や虚血性疾患等の嫌気的環境下にある疾患（以下、嫌気的疾患という）の治療方法においては、用いる遺伝子輸送担体が非病原性で、且つ、嫌気的状態にある疾患組織等だけにおいて生着、増殖し、嫌気的状態ではない正常な組織では生着、増殖しない偏性嫌気性菌であることが求められる。
さらに、用いる遺伝子輸送担体の形質転換遺伝子が、当該遺伝子輸送担体以外の、病原性菌または好気性若しくは通性嫌気性菌に水平伝達しないこと、さらに、例え水平伝達したとしても、その菌で複製されないことも極めて重要である。そのために、当該形質転換遺伝子輸送担体の作製に用いられる発現ベクターは、当該形質転換菌だけで複製され、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌では複製されないものが望ましい。
【００１４】
これまでに報告されている発現ベクターは、殆どが形質転換菌と当該形質転換菌以外の菌、例えば大腸菌とで相互複製するシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌だけで複製される発現ベクターではない。
本発明の課題は、大腸菌以外の形質転換菌のみで複製され、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌では複製されない発現ベクターを提供することにある。
また、本発明の他の課題は、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該形質転換菌を含有する嫌気的疾患治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、先に、目的遺伝子として、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の中のＣＤを発現する遺伝子を選択し、当該目的遺伝子を組みこむプラスミドベクターとして、当該ＣＤを発現する遺伝子を保有している大腸菌のプラスミドとビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラスミドとを融合したシャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤを作製し、これを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤが悪性腫瘍の治療に有用な遺伝子輸送担体として期待できることを見出し、報告した（特許文献４）。
【００１６】
本発明者らは、さらに、上記融合プラスミドに改良を加えるべく、組み込まれた目的遺伝子のＤＮＡを一部変異化させて、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤのプラスミド一塩基変異体のプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を作製し、これを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８及びその作製方法を報告した（特許文献６）。
これらのプラスミドは何れも、ビフィドバクテリウムと大腸菌とで相互複製されるシャトルプラスミドであることから、何らかの要因により大腸菌へ水平伝達を起こした場合には、当該大腸菌で複製されるものであった。
【００１７】
そこで、本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、上記プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８から、大腸菌の複製開始点を含む断片のｐＵＣ ｏｒｉを取り除いたプラスミドｐＢｉｆｉＣＤを作製し、本プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（タカラバイオ株式会社）を、熱ショック法により形質転換を行ったところ、本願発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤによって大腸菌が形質転換されず、水平伝達のおそれがない事が確認された。
【００１８】
そして、本プラスミドで形質転換した菌、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５Ａを組換えた、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ、〒２９２−０８１８千葉県木更津市上総鎌足２−５−８）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）は、良好なＣＤ発現作用を示し、該ＣＤによって抗腫瘍物質の５−ＦＵに変換されるプロドラッグの５−ＦＣを併用する事により、極めて顕著な腫瘍増殖抑制効果を発揮し、極めて優れた固形腫瘍治療剤として期待できるものである。
しかも、驚くべき事に、プラスミド保持安定性が高く、さらに、大腸菌の複製開始点を含まないことから、万一、大腸菌への水平伝達を起こしたとしても、大腸菌で複製される可能性がなく、極めて安全で、且つ、高品質の遺伝子輸送担体として期待できることを見出し、本発明を成した。
【００１９】
すなわち本発明は、
［１］嫌気性微生物で機能するプラスミドベクターであって、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクター、
［２］嫌気性微生物が、大腸菌以外の腸内細菌である［１］記載の発現ベクター、
［３］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる一種である［２］記載の発現ベクター、
【００２０】
［４］（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の発現ベクター、
［５］大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種で機能するプラスミド複製ユニットである、［４］記載の発現ベクター、
【００２１】
［６］大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットである、［５］記載の発現ベクター、
［７］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが、ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットである、［６］記載の発現ベクター、
［８］ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットをコードする遺伝子が、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、［７］記載の発現ベクター、
【００２２】
［９］嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種で機能するプロモーターおよびターミネーターである、［４］〜［８］のいずれかに記載の発現ベクター、
［１０］嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターおよびターミネーターである、［９］記載の発現ベクター、
【００２３】
［１１］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターである、［１０］記載の発現ベクター、
［１２］ビフィドバクテリウム属細菌で機能するヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターである、［１１］記載の発現ベクター、
【００２４】
［１３］ヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターをコードする遺伝子が、配列番号４の７番目から３６７番目および１６７６番目から１７８９番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形である、［１２］記載の発現ベクター、
［１４］目的とする活性を有する蛋白質が、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質である、［４］〜［１３］記載の発現ベクター、
［１５］嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［１４］記載の発現ベクター、
【００２５】
［１６］嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［１５］記載の発現ベクター、
［１７］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選ばれる一種である、［１６］記載の発現ベクター、
［１８］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、［１７］記載の発現ベクター、
【００２６】
［１９］シトシン・デアミナーゼをコードする遺伝子が、配列番号４の３９５番目から１６７５番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、［１８］記載の発現ベクター、
［２０］さらに、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットを含み、選択マーカー活性が、薬剤耐性、栄養要求性および培地選択性からなる群より選ばれる１種である、［４］〜［１９］のいずれかに記載の発現ベクター、
［２１］選択マーカー活性が、スペクチノマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性およびカナマイシン耐性からなる群より選ばれる１種の薬剤耐性である、［２０］に記載の発現ベクター、［２２］選択マーカー活性が、スペクチノマイシン耐性である、［２１］記載の発現ベクター、
【００２７】
［２３］選択マーカー活性を発揮する蛋白質をコードするＤＮＡが、スペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡである、［２２］記載の発現ベクター、
［２４］スペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとそのプロモーター配列とを含むＤＮＡが、配列番号４の３３９８番目から４４７６番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形である、［２３］記載の発現ベクター、および、
［２５］配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ配列を含む、［２４］記載の発現ベクター（ｐＢｉｆｉＣＤ）に関する。
【００２８】
また本発明は、
［２６］（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを含む、大腸菌と大腸菌以外の宿主菌で相互複製されるシャトルプラスミドを作製し、該シャトルプラスミドから、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去することを特徴とする、発現ベクターの作製方法に関する。
【００２９】
さらに本発明は、
［２７］［１］〜［２５］のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、
［２８］嫌気性微生物が、大腸菌以外の腸内細菌である、［２７］記載の遺伝子輸送担体、
［２９］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種である、［２８］記載の遺伝子輸送担体、
［３０］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌である、［２９］記載の遺伝子輸送担体、
【００３０】
［３１］ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムからなる群より選ばれる１種である、［３０］記載の遺伝子輸送担体、
［３２］ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、［３１］記載の遺伝子輸送担体、
【００３１】
［３３］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質を発現することができる、［２７］〜［３２］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体、
［３４］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［３３］記載の遺伝子輸送担体、
［３５］嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［３４］記載の遺伝子輸送担体、
【００３２】
［３６］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選ばれる一種である、［３５］に記載の遺伝子輸送担体、
［３７］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、［３６］に記載の遺伝子輸送担体、
および、
［３８］遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）である、［３７］に記載の遺伝子輸送担体に関する。
【００３３】
さらに本発明は、
［３９］［２７］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、
［４０］［３４］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質によって抗腫瘍物質に変換される抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる医薬組成物、および、
［４１］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼであり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、［４０］に記載の医薬組成物に関する。
【００３４】
さらにまた本発明は、
［４２］有効治療量の抗腫瘍活性を有する蛋白質を発現するに十分な量の、［３４］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する固形腫瘍治療剤、
［４３］抗腫瘍物質前駆体から有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現するに十分な量の、［３４］〜［３８］のいずれかに記載の遺伝子輸送担体と、該遺伝子輸送担体が発現することができる前記蛋白質によって変換され、かつ、有効治療量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体とを組み合わせてなる、固形腫瘍治療剤、および、
［４４］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質がシトシン・デアミナーゼであり、抗腫瘍物質前駆体が５−フルオロシトシンである、［４３］に記載の固形腫瘍治療剤に関する。
【００３５】
なお、本願明細書においては、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、や（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、以下、「目的蛋白質をコードするＤＮＡ」という場合もある。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の発現ベクターは、形質転換菌以外の菌、特に、大腸菌で機能する複製開始点を含まず、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌で複製されるおそれがない、極めて安全なベクターである。
そして、本発明の発現ベクターを用いて形質転換した遺伝子輸送担体は、プラスミド保持安定性が高く、しかも上記のとおり、形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば、大腸菌への水平伝達を起こしたとしても、当該菌で複製されるおそれがない。従って、極めて安全で、高品質の遺伝子輸送担体として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】選択マーカープラスミド（ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の構築工程（工程１）を示す図である。
【図２】選択マーカー・活性蛋白質プラスミド（ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の構築工程（工程２）を示す図である。
【図３】シャトルプラスミド（ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ）の構築工程（工程３）を示す図である。
【図４】プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」の構築工程（工程４）を示す図である。
【図５】B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株の抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の発現ベクターは、嫌気性菌、特に、大腸菌以外の腸内細菌、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、クロストリジウム属細菌等で機能するプラスミドベクターであって、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを具有しない発現ベクターである。
より具体的には、例えば、（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットと、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットからなり、且つ、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクターである。
【００３９】
これまでに報告されているプラスミドベクターは、殆どが遺伝子導入技術情報の豊富さや導入の確実さなどから、大腸菌由来のプラスミドと形質転換菌由来のプラスミドを融合したものである。そして、大腸菌と形質転換菌との双方で機能するシャトルベクターであり、大腸菌以外の形質転換菌のみで機能する発現ベクターではない。
本発明の発現ベクターは、例えば、（１）大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットから本質的になり、且つ、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない点に特徴を有するものである。
【００４０】
本発明の発現ベクターが具有する、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットとしては、大腸菌以外の嫌気性微生物、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌またはクロストリジウム属細菌等の腸内細菌で機能し、形質転換菌以外の嫌気性微生物で機能しないプラスミド複製ユニットであればいかなるものでもよく、大腸菌以外の嫌気性微生物、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが挙げられる。具体的には、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニット又はその一塩基変異多形を例示することができ、より具体的には、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
【００４１】
また、本発明の発現ベクターが具有する、蛋白質発現ユニットのプロモーター及びターミネーターとしては、嫌気性微生物、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌またはクロストリジウム属細菌等の腸内細菌で機能するプロモーター及びターミネーターであればいかなるものでもよく、例えば、嫌気性微生物で機能するヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーター、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができ、具体的には、それぞれ配列番号４の７番目から３６７番目および１６７６番目から１７８６番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
【００４２】
さらに、本発明の発現ベクターは、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットをさらに含んでよい。本発明の発現ベクターが具有する選択マーカー活性としては、本発明のプラスミドベクターで形質転換された嫌気性微生物を選別できるものであれば特に制限されず、例えば、スペクチノマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、ネオマイシン耐性、カナマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーや、栄養要求性などが挙げられ、スペクチノマイシン耐性が好ましい。
【００４３】
そして選択マーカー活性遺伝子ユニットとしては、例えば、スペクチノマイシン耐性活性を発揮する蛋白質をコードするＤＮＡの一塩基変異体とそのプロモーター配列とを含むＤＮＡ、例えば、エンテロコッカス・フェカリス由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（以下、ＡＡＤ９カセットという）又はその一塩基変異多形を例示することができ、具体的には、配列番号４の３３９８番目から４４７６番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
なお、本発明で言う一塩基変異体とは、少なくとも１箇所の塩基が変異した一塩基変異多形（以下、ＳＮＰという）を意味し、１箇所のみでのＳＮＰだけでなく、複数個所でのＳＮＰを含む。
【００４４】
本発明の発現ベクターが具有する蛋白質発現ユニットに組み込まれる遺伝子は、例えば、本発明の嫌気的疾患治療剤を悪性腫瘍治療剤として用いる場合は、抗腫瘍活性を有する蛋白質あるいは抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質等を発現する遺伝子であって、巨大サイズＤＮＡ（約１０ｋｂ以上）や受容細胞に有毒となるＤＮＡなど形質転換を阻害するＤＮＡでなければ、いかなるものであってもよい。
【００４５】
当該遺伝子が発現する抗腫瘍活性を有する蛋白質は、例えばサイトカインを含み、具体的なサイトカインとしては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、１β、２、３、４、６、７、１０、１２、１３、１５、１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、リンホトキシン（ＬＴ）−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、Ｔ細胞活性化共刺激因子Ｂ７（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）、キット・リガンド、オンコスタチンＭ等が挙げられる。また、エンドスタチン、アンジオスタチン、クリングル−１、２、３、４、５等の血管新生抑制物質も挙げられる。
これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてＰＣＲ法等の公知の手法を利用することにより、本発明に用いる抗腫瘍活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを入手することができる。
【００４６】
また、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質としては、５−フルオロシトシン（以下、５−ＦＣという）を抗腫瘍活性物質の５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵという）に変換する酵素のシトシン・デアミナーゼ（以下、ＣＤという）や、５−アジリジノ−２，４−ジニトロベンズアミド（以下、ＣＢ１９４５という）を抗腫瘍活性アルキル化剤に変換する酵素のニトロリダクターゼや、ガンシクロビルを抗腫瘍活性代謝物に変換する酵素の単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（以下、ＨＳＶ１−ＴＫという）や、グルクロン酸抱合抗腫瘍活性物質を抗腫瘍活性物質に変換する酵素のβ−グルクロニダーゼなどを挙げることができる。好ましくは、５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素のＣＤを挙げることができる。
【００４７】
ＣＤをコードするＤＮＡは、例えば、大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＡｄｅｘ １ ＣＳＣＤ（理化学研究所 ジーンバンク ＲＤＢ Ｎｏ．１５９１）、又は同じく大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＫ１１６から単離されるものであってよい（D.A.Mead et al.,Protein Engineering 1:67-74(1986)）。
大腸菌由来のＣＤをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４の３９５番目から１６７５番目の塩基配列で示されるＤＮＡ又はその一塩基変異多形を例示することができる。
【００４８】
さらに、本発明の嫌気的疾患治療剤を虚血性疾患治療剤として用いる場合は、本発明の発現ベクターが具有する蛋白質発現ユニットに組み込まれる遺伝子として、虚血性疾患治療に有用な血管新生促進活性を有する蛋白質も挙げることができる。具体的には、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを挙げることができる。
同様に、これらの蛋白質の配列は様々な生物において知られており、その配列情報に基づいてＰＣＲ法等の公知の手法を利用することにより、本発明に用いる血管新生促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを入手することができる。
【００４９】
本発明のベクターは、例えば、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよび嫌気性微生物で機能するプロモーター並びにターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットと、選択マーカー活性遺伝子ユニットからなり、嫌気性微生物に形質転換した場合にその嫌気性微生物内において機能するもので、形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まないプラスミドであればいかなるものも含まれる。
【００５０】
例えば、上記文献に報告されている、シャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４）、ｐＡＶ００１（特許文献５）、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１（Tanaka et al., 2005, Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425）、ｐＤＧ７、ｐＥＢＭ３、ｐＥＣＭ２、ｐＬＰ８２５など（非特許文献５）に、目的とする活性を有する任意の蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを組み込み、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去したものなどを挙げることができる。
【００５１】
あるいは、ｐＮＴＲ５００Ｆ、ｐＣＤ５４０ＦＴなど（特許文献１〜３）、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅ−ＣＤ（特許文献５）ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献６）など若しくは、当該プラスミドに組み込まれた蛋白質発現ユニットを、別の、任意の蛋白質発現ユニットに組換え、さらに、それから大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去したものなどを挙げることができる。
【００５２】
本発明の発現ベクターの具体的な例示として、例えば、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットとして、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットを具有し、嫌気性微生物で機能するプロモーター並びにターミネーターを含むＤＮＡ断片として、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを具有し、目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとして、５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素のＣＤをコードするＤＮＡを具有し、選択マーカー活性遺伝子ユニットとして、エンテロコッカス・フェカリス由来のスペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（ＡＡＤ９カセット）を含むベクターを挙げることができる。
より具体的な例示として、例えば、配列番号４の塩基配列で示される、ｐＢｉｆｉＣＤを挙げることができる。
【００５３】
本発明のベクターは、例えば、以下のようにして作製することができる。
例えば、
（１）大腸菌の複製開始点、例えばｐＵＣ ｏｒｉと選択マーカー活性遺伝子ユニット、例えば、ＡＡＤ９カセットを含むプラスミド（以下、選択マーカープラスミドという）を作製（以下、工程１という）し、
（２）この選択マーカープラスミドの直鎖化プラスミドを調製し、これと、プロモーター及びターミネーター、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌由来のヒストン様ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターと、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質、例えば、ＣＤを含む断片（以下、蛋白質発現ユニットという）をライゲーションして、選択マーカー活性遺伝子ユニットと蛋白質発現ユニットを有するプラスミド（以下、選択マーカー・活性蛋白質プラスミドという）を作製（以下、工程２という）し、
【００５４】
（３）この選択マーカー・活性蛋白質プラスミドの直鎖化プラスミドを調製し、これと、大腸菌以外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニット、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットのＤＮＡ断片（以下、プラスミド複製ユニットという）をライゲーションして、大腸菌の複製開始点及び選択マーカー活性遺伝子ユニット、蛋白質発現ユニット並びにプラスミド複製ユニットを有するプラスミド（以下、シャトルプラスミドという）を作製（以下、工程３という）し、
（４）このシャトルプラスミドから大腸菌の複製開始点を除去（以下、工程４という）することにより作製することができる。
なお、各工程における操作は、文献記載の公知の方法に準じて行うことができる。
【００５５】
ベクターはまた、上記の各種シャトルプラスミド、例えば、シャトルプラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４）、ｐＡＶ００１（特許文献５）、ｐＢＲＡＳＴＡ１０１（Tanaka et al., 2005, Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(2): 422-425）、ｐＤＧ７、ｐＥＢＭ３、ｐＥＣＭ２、ｐＬＰ８２５など（非特許文献５）、ｐＮＴＲ５００Ｆ、ｐＣＤ５４０ＦＴなど（特許文献１〜３）に、常法に従って、目的とする活性を有する任意の蛋白質をコードするＤＮＡならびに該嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを組み込み、次いで、同様に、常法により、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去する事により作製することもできる。
【００５６】
さらに、プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献６）から、大腸菌の複製開始点を含む断片のｐＵＣ ｏｒｉを取り除いた、上記本発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤと同様に、本発明のベクターはまた、プラスミドｐＮＴＲ５００Ｆ、同ｐＣＤ５４０ＦＴ（特許文献１〜３）、同ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（特許文献５）などから、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去する事によっても作製することができる。
【００５７】
さらにまた、プラスミドｐＮＴＲ５００Ｆ、ｐＣＤ５４０ＦＴ（特許文献１〜３）、ｐＢＬＥＳ１００−Ｓ−ｅＣＤ（特許文献４）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ（特許文献５）、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献６）などから、当該プラスミドに組み込まれた蛋白質発現ユニットを、別の、任意の蛋白質発現ユニットに組換え、さらに、それから大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去する事によっても作製することができる。
【００５８】
本発明の嫌気的疾患治療用遺伝子輸送担体は、形質転換する任意の嫌気性微生物を、上記本発明の発現ベクターを用いて、遺伝子工学分野の公知の方法にしたがって形質転換する事により作製することができる。
本発明の発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物は、固形腫瘍等の嫌気的疾患の治療剤に用いるものであるから、当該嫌気性微生物としては、偏性嫌気性で且つ非病原性であることが必須であり、クロストリジウムやサルモネラなどの病原性の菌であっても非病原性化したものであればよく、また、ラクトバチルスなどの通性嫌気性菌であっても偏性嫌気性に変異化したものであればよい。
好ましくは非病原性の嫌気性バクテリアが挙げられ、より好ましくは非病原性の腸内細菌が挙げられ、中でも、ビフィドバクテリウム属細菌が最も好ましい。
【００５９】
ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えばビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが挙げられ、ビフィドバクテリウム・ロンガムが最も好ましい。
これらの菌は、いずれも市販されているか、又は寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ−１５７０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ−１１８６３、ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ−１５６９７等は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）から容易に入手することができる。
【００６０】
また、それぞれの菌の株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの株については、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ−１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ−６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１−２株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株が好ましい。
ビフィドバクテリウム・ブレーベの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ−５３−８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ−１株が好ましい。
【００６１】
ビフィドバクテリウム・インファンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ−１０−５株が好ましい。
また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの株については、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２２０）を挙げることができる。
【００６２】
本発明の遺伝子輸送担体は、本発明の発現ベクターで形質転換された上記の嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体であり、嫌気的環境下にある組織内で生育でき、且つ、目的とする活性を有する蛋白質を発現することができ、さらに、形質転換菌以外の、特に病原性又は好気性若しくは通性嫌気性微生物への水平伝達のおそれがほとんどまたは全くないものであれば特に制限されない。
【００６３】
本発明の遺伝子輸送担体の好ましい例示としては、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる遺伝子輸送担体を挙げることができる。より好ましくは、嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、且つ、５−ＦＣを５−ＦＵに変換する酵素のＣＤを発現することができるビフィドバクテリウム属細菌を含む遺伝子輸送担体を挙げることができる。特に好ましい例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１として２００８年２月１９日付で寄託された、ｐＢｉｆｉＣＤで形質転換されたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ株（ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ；ＮＰＭＤ受領番号：ＮＩＴＥ ＡＢＰ−４９１）が挙げられる。
【００６４】
本発明の遺伝子輸送担体の作製は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル（講談社）、高木康敬編遺伝子操作実験法（講談社）、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２）、モレキュラー・クローニング第２版（Molecular C1oning,2nd ed.）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８９）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.），１９４（１９９１）、等に記載された方法に従って行うことができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。また、本発明の嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体を含有している限り特に制限はされない。
また、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体の２種以上を含有していてもよい。
さらに、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の遺伝子輸送担体以外の嫌気的疾患治療効果を示す化合物を含有する医薬組成物や嫌気性疾患治療剤と組み合わせて用いることができる。
【００６６】
また、本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、本発明の効果を妨げない限り、本発明の遺伝子輸送担体のほかに任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分として、例えば、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。
【００６７】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の剤型は特に制限されないが、例えば、本発明の遺伝子輸送担体を含有する液剤あるいは固形製剤を挙げることができる。液剤は、本発明の遺伝子輸送担体の嫌気性菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩液若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。また、固形製剤は、液剤に適当な保護剤を添加してアンプル又はバイアル瓶などに充填した後凍結乾燥又はＬ乾燥するか、液剤に適当な保護剤を添加して凍結乾燥又はＬ乾燥した後これをアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射が最も好ましい。
【００６８】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤の遺伝子輸送担体の投与量は、疾患部位において生育でき、且つ、有効治療量の活性蛋白質を発現するのに十分な量である限り特に制限はされないが、経済上の観点及び副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。
【００６９】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤における遺伝子輸送担体の投与量は、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。
例えば、本発明の嫌気的疾患治療剤を固形腫瘍治療剤として用いる際には、用いる嫌気性微生物の菌自体が示す抗腫瘍活性、用いる嫌気性微生物が産生する抗腫瘍活性を有する蛋白質の種類、抗腫瘍物質前駆体から変換される抗腫瘍物質の有効治療量、および用いる嫌気性微生物の当該活性蛋白質の産生量などによって、適宜設定する。
【００７０】
具体的には、例えば静脈内投与の場合には、特に、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、または適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性微生物の菌体を、１日体重１ｋｇ当たり１０６〜１０１２ｃｆｕを１〜複数回に分け、１〜複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明の嫌気性微生物の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、または適当な補液で希釈して、１日１回〜数回に分け、１日〜数日連続して投与する。
【００７１】
また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合は、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本発明の嫌気性微生物の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０６〜１０１２ｃｆｕを１日１回〜複数回、必要に応じ１日〜複数日間、連続してまたは適宜、間隔をおいて投与する。より具体的には、本発明の嫌気性微生物の菌体を１０４〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１〜１０００ｍＬを直接、好ましくは１日１回〜数回、必要に応じ１〜数日連続して投与する。
治療期間中に疾患組織中の菌が消失していることが確認された場合は、一旦治療を中断し、上記と同様にして菌を投与する。
【００７２】
本発明の遺伝子輸送担体や嫌気的疾患治療剤が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる遺伝子を組み込んだ嫌気性菌の場合、当該遺伝子輸送担体を活性成分として含有する本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤は、当該遺伝子輸送担体によって発現される蛋白質によって有効量の抗腫瘍物質に変換できる量の抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて使用する。この抗腫瘍物質前駆体は本発明の遺伝子輸送担体を活性成分として含有する医薬組成物や固形腫瘍治療剤に含有させてもよいが、当該抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物として、本発明の遺伝子輸送担体を活性成分として含有する医薬組成物や固形腫瘍治療剤と組み合わせて用いることが好ましい。
【００７３】
本発明に用いる抗腫瘍物質前駆体は、前駆体（プロドラッグ）の状態では正常組織に対する副作用が少なく、かつ、抗腫瘍物質に変換後は、治療の対象である各種固形腫瘍に対して高い治療効果を有する抗腫瘍物質前駆体であれば特に制限されないが、例えば前述の、５−ＦＵのプロドラッグである５−ＦＣ、抗腫瘍活性アルキル化剤に変換されるＣＢ１９４５、抗腫瘍活性代謝物に変換されるガンシクロビルやグルクロン酸抱合抗腫瘍活性物質等が挙げられる。
【００７４】
このように、抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤を用いる場合、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与方法と、抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の投与方法は同じであっても異なっていてもよく、また、投与も同時であっても隔時であってもよいが、抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の投与は、本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤の投与後、本発明の遺伝子輸送担体が腫瘍細胞で十分生育できる時間をおいた後に投与する方が好ましい。
【００７５】
また、抗腫瘍物質前駆体と組み合わせて本発明の医薬組成物や固形腫瘍治療剤を用いる場合、遺伝子輸送担体が嫌気性環境下にある腫瘍細胞組織でのみ生着・増殖して、そこで局所的に活性蛋白質を産生するため、通常の抗腫瘍物質前駆体を用いる固形腫瘍の治療方法と比較して、副作用をはるかに低減することができ、かつ、抗腫瘍物質前駆体の投与量も広範に設定することができる。
【００７６】
抗腫瘍物質前駆体を含有する医薬組成物の剤型は特に制限されず、通常の、散剤、錠剤、カプセル剤などの経口用剤および、座剤、注射剤などの非経口用剤のいずれであってもよい。このような医薬組成物は、通常の製剤学上の手法にしたがって製造することができる。
抗腫瘍物質前駆体の投与量は、組み合わせて使用する遺伝子輸送担体の腫瘍組織における生育率、及び抗腫瘍物質前駆体から抗腫瘍物質への変換効率に応じて適宜選択することができる。また、遺伝子輸送担体の投与量と同様に、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することもできる。
例えば、実際の治療では、用いる抗腫瘍物質前駆体および変換された抗腫瘍物質の種類、抗腫瘍物質前駆体から変換される抗腫瘍物質の有効治療量、用いる嫌気性微生物が産生する抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質の種類、ならびに用いる嫌気性微生物の当該活性蛋白質の産生量などによって、投与量を適宜設定する。
【００７７】
具体的には、例えば、本発明の遺伝子輸送担体の、ＣＤ遺伝子を導入した、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）を活性成分として含有する医薬組成物と抗腫瘍物質前駆体の５−ＦＣを活性成分として含有する医薬組成物を組み合わせて投与する場合には、腫瘍組織中に菌が生着、増殖し、且つ、血液中および正常組織中において菌の消失が確認された後、５−ＦＣを、成人の体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ／日を１日１回〜複数回に分け、治療期間中連続して投与する。投与方法としては、経口投与が好ましいが、静脈内投与あるいは肛門内投与などの非経口投与を行うこともできる。
【００７８】
なお、本発明における「ＸとＹと組み合わせてなる」には、ＸとＹを別の形態としたもの、ＸとＹを同一の形態（例えばＸとＹを含有する形態）としたもののいずれの場合も含む。また、ＸとＹを別の形態としたものの場合、Ｘ、Ｙのいずれも他の成分をさらに含有している場合も含まれる。
【００７９】
本発明の医薬組成物や嫌気的疾患治療剤は、嫌気的環境下にある疾患、好ましくは各種固形癌に適用できる。固形癌としては、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、扁平上皮癌などが挙げられる。
また、嫌気的環境下にある他の疾患としては、虚血性疾患、例えば、心筋梗塞または閉塞性動脈硬化症や、バージャー病などの下肢虚血疾患等を挙げることができる。
【実施例】
【００８０】
以下、参考例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［参考例１］
鋳型ＤＮＡの調製
各実施例において鋳型とする各プラスミドＤＮＡは、０．１×ＴＥを用いて、１０ｐｇ／μＬに濃度を調整し、使用時まで−３０℃の冷凍庫にて冷凍保存した。鋳型とした各プラスミドＤＮＡを以下の表１に示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
［参考例２］
プライマーの調製
ＰＣＲ増幅及び確認用に用いる各プライマーは、０．１×ＴＥにて溶解し１００μＭのストック溶液を調製した。これを０．１×ＴＥにて更にうすめ２０μＭのプライマー溶液を調製した。使用時まで−３０℃の冷凍庫にて冷凍保存した。用いたプライマーを以下の表２に示す。
【００８３】
【表２】
【００８４】
［参考例３］
アガロースゲル電気泳動
以下の各実施例における、アガロースゲル電気泳動は以下のように行った。
サンプルを必要に応じて０．１×ＴＥにて１０倍程度に希釈し、０．８％或いは２％分析用アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド入り）を用いて電気泳動を行った。アガロースゲルの濃度は、サンプルＤＮＡの大きさにより決定した。ＤＮＡの分子量マーカーを別レーンにて同時に電気泳動し、サンプルのＤＮＡサイズを確認した。
また、サンプルの定量が必要な場合は、FastRular DNA Ladder, Low Range (Fermentas)やFastRular DNA Ladder, Middle Range (Fermentas)などの定量マーカーを用いた。定量マーカーの各バンド量は５ｎｇから５０ｎｇ程度とした。
電気泳動後、ゲルにＵＶを照射し、定量マーカーとサンプルとのＤＮＡ濃度を比較し、サンプルのＤＮＡ濃度を見積もった。
【００８５】
［実施例１］
選択マーカープラスミド（ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の作製（工程１）
以下の手順に従って、プラスミドｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉを作製した。
（１）ｐＵＣｏｒｉ断片の調製（約７００ｂｐ）
ｐＵＣｏｒｉのＰＣＲ増幅の条件検討
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋を鋳型に用いて、滅菌済み０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／μＬ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ ５μＬ、５×PrimeSTARＴＭ buffer１０μＬ、ｄＮＴＰ mixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭ ｐＵＣｏｒｉ−Ｆ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ｐＵＣｏｒｉ−Ｒ１プライマー０．５μＬ、PrimeSTARＨＳＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ、および、滅菌精製水２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。
【００８６】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数１】
ＰＣＲ終了後の反応液を１μＬ及び３μＬ用いて、参考例３に示したアガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物の確認を行った。なお、ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
アガロースゲル解析により目的の約７００ｂｐのシングルバンドの増幅が確認され、その収量は約１μｇであった。
【００８７】
追加ＰＣＲ
上記で設定した条件にて５チューブ分の追加ＰＣＲを行い、合わせて約１０μｇのＰＣＲ産物を得た。
精製（タンパク質除去及び濃縮）
上記ＰＣＲ反応液全てをまとめた後、QIAquick PCR purification kit(Qiagen)を用いて精製を行い、常法に従いプライマーおよびタンパク質を除去した。ＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記の精製ＰＣＲ産物を０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、アガロースゲル電気泳動にて定量した。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
【００８８】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＢｇｌＩＩにて以下のように切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＢｇｌＩＩを５５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて２時間保温後、参考例４記載の方法に従ってたんぱく質除去を行った。これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を３０μＬ、ＢｃｕＩを２５５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて３００μＬとした。３７℃にて２時間保温後、QIAquick PCR purification kit(Qiagen)にて精製を行い、５０μＬの０．１×ＴＥにて溶出した。
【００８９】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断後のＰＣＲ産物に１／１０量の１０×loading buffer（タカラバイオ株式会社）を加えよく混ぜ、電気泳動のサンプルとした。２％精製用アガロースゲルを１×ＴＡＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド入）を満たした電気泳動槽（Mupid，コスモバイオ）にセットし、上記電気泳動サンプルをアプライし、５０Ｖにて低温室（４℃設定）で電気泳動を行った。分子量マーカー（FastRular DNA ladder, Low Range, Fermentas）を別レーンにて同時に流した。
ＤＮＡの移動度は、上記アガロースゲルにＵＶハンドモニター（ＵＶＰ）にて３６５ｎｍのＵＶを照射して確認した。電気泳動開始から１３０分後に、約７００ｂｐの目的のバンドが、ゲルの１／２程度の場所に到達した時に電気泳動を終了し、電気泳動槽からゲルを取り出した。
このゲルに３６５ｎｍのＵＶを照射しながら目的のＤＮＡバンドを滅菌したナイフの刃（Sterile Surgical Blades, RuettgersHmbH&Co.KG）にて切り出した。切り出したゲルを細かくスライスし、これを予め重量を測定した滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに入れた。
【００９０】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記切り出しゲルを入れた２ｍＬマイクロチューブの重量を量り、先に量った空チューブ重量を差し引いてゲル重量を算出した。QIAquick Gel Extraction Kitを用いて本キットの製品説明書に従いゲルからＤＮＡを抽出した。最終工程のＤＮＡ溶出は、０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を、０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、精製したＰＣＲ産物を、分光光度計を用いて定量した。また、２％分析用アガロースゲルを用いてアガロースゲル電気泳動を行った。
上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理、アガロースゲルからのＤＮＡ断片切り出し、精製を行った後のＤＮＡ断片について、アガロースゲル解析で、シングルバンドであることを確認した。また、吸光光度計によるＤＮＡ測定により、濃度を測定した結果、濃度は６６ｎｇ／μＬであった。さらに、純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９１１であった。
【００９１】
（２）ＡＡＤ９断片の調製（約１．１ｋｂｐ）
ＡＡＤ９遺伝子のＰＣＲ増幅の条件検討
ｐＢＬＥＳ１００を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／μＬ ｐＢＬＥＳ１００ ５μＬ、５×PrimeSTARＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ） ４μＬ、２０μＭ ＡＡＤ９−Ｆ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＡＡＤ９−Ｒ１プライマー０．５μＬ、PrimeSTARＨＳ ＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。
【００９２】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数２】
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬ 及び３μＬを用いて、アガロースゲル電気泳動法により、ＰＣＲ産物の確認を行った。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
アガロースゲル解析により、目的の約１．１ｋｂｐのシングルバンドの増幅が確認された。また、収量は約１μｇであった。
【００９３】
追加ＰＣＲ
上記と同様にしてチューブ５本分の追加ＰＣＲを行い、合わせて約１０μｇのＰＣＲ産物を得た。
精製（タンパク質除去及び濃縮）
上記、ＰＣＲ反応液全てをまとめた後QIAquick PCR purification kitを用いて精製を行い、常法によりプライマー及びタンパク質を除去した。ＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
この精製ＰＣＲ産物を、０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、これをアガロースゲル電気泳動法にて定量した。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
【００９４】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＢｇｌＩＩにて以下のように切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＢｇｌＩＩを３６ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて２時間保温後タンパク質除去を行った。これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を３０μＬ、ＢｃｕＩを１６５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて３００μＬとした。３７℃にて２時間保温後QIAquick PCR purification kitにて精製を行い、５０μＬの０．１×ＴＥにて溶出した。
【００９５】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したＰＣＲ産物を、上記、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて１３０分間電気泳動を行って分画し、約１．１ｋｂｐの目的のバンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用した。
【００９６】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記切り出しゲルを入れた２ｍＬマイクロチューブの重量を量り、先に量った空チューブ重量を差し引いてゲル重量を算出した。QIAquick Gel Extraction kitを用いて本キットの製品説明書に従いゲルからＤＮＡを抽出した。最終工程のＤＮＡ溶出は、０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を、０．１×ＴＥにて１０倍に希釈し、精製したＰＣＲ産物を、分光光度計を用いて定量した。また、２％分析用アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。
上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理、アガロースゲルからのＤＮＡ断片切り出し、精製を行った後のＤＮＡ断片について、アガロースゲル解析で、シングルバンドを確認した。また、吸光光度計によるＤＮＡ測定により濃度を測定した結果、その濃度は４０ｎｇ／μＬであった。さらに、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９２７であった。
【００９７】
（３）ｐＵＣ ｏｒｉ断片とＡＡＤ ９断片のライゲーション
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、ｐＵＣｏｒｉ精製断片（約７００ｂｐ）とＡＡＤ９精製断片（約１．１ｋｂｐ）をモル比で１：３、重量比では１：５となるように、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＵＣｏｒｉ断片（６６ｎｇ／μＬ）０．７５μＬ（５０ｎｇ）、ＡＡＤ９断片（４０ｎｇ／μＬ）６．２５μＬ（２５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ ８μＬを氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液１）を調製した。
コントロールとして、ＡＡＤ９精製断片のみの反応液（反応液２）を調製した。すなわち、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ＡＡＤ９断片（４０ｎｇ／μＬ）６．２５μＬ（２５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡ理ガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ ８．７５μＬを氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液２）とした。
【００９８】
ＡＡＤ９断片は、プラスミドｐＢＬＥＳ１００（特許文献４：特開２００２−９７１４４）を鋳型として用いているので、僅かでも混入した場合、後の大腸菌の形質転換工程の後にバックグランドとしてコロニー形成をする。反応液２は、このバックグランド確認用のコントロールとした。
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せ、ライゲーションした。
【数３】
【００９９】
（４）大腸菌の形質転換
上記ライゲーション反応後の溶液を１μＬ使用し、E.coli ＪＭ１０９の形質転換をヒートショックにより行った。形質転換の操作方法は、Takara E.coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ株式会社）の製品説明書に記載の方法に従いった。形質転換後のＳＯＣ懸濁液は、原液及びＳＯＣで１０倍にうすめた希釈液の２種についてそれぞれ１００μＬずつ２枚のＬＢ寒天培地（７５μｇ／ｍＬ ＳＰＣＭ含有）に塗抹した。ライゲーション反応液１及び２を用いて形質転換した大腸菌の塗抹プレートをそれぞれプレート１及び２とした。これらのプレートを３７℃に設定したインキュベータに入れ、１晩培養した。プレート上に形成されたコロニー数を計測した。
精製ｐＵＣｏｒｉ断片と精製ＡＡＤ９断片のライゲーション産物（ライゲーション反応液１）を用いた形質転換では、１０倍希釈菌液１００μＬあたり２８個及び３７個のコロニーが選択培地上に形成されたのに対し、コントロールの反応液２を用いた形質転換ではコロニーは形成されなかった。バックグランドが極めて低く、ライゲーション及び形質転換が良好に行われたことが示唆された。
【０１００】
（５）プラスミドの確認
組換え大腸菌の培養
上記プレート１上のコロニーを無作為に６つ選び、これらを用いて培養を行った。２×ＬＢを滅菌済みの１００ｍＬ容ガラス製三角フラスコに２０ｍＬ入れ、これに７５ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシンを２０μＬ加え、よく混ぜた。各コロニーを、白金耳にて釣菌し、上記の培地にそれぞれ懸濁した。これを３７℃に設定した振とう培養機にセットし、３７℃にて１９．５時間振とう培養した。
【０１０１】
プラスミドＤＮＡの抽出
上記各培養液を２ｍＬの滅菌したマイクロチューブ２本に１．５ｍＬずつ入れた。残りの培養液は、プラスミドの抽出が完了するまでの間氷中に置いた。上記の分注した培養液より、GeneEluteＴＭ Plasmid Miniprep Kitを用いて同キットの製品説明書に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。最終工程のプラスミドＤＮＡの溶出は、５０μＬの０．１×ＴＥを用いた。
【０１０２】
プラスミドＤＮＡの濃度測定
上記で抽出したプラスミドを０．１×ＴＥにて２０倍にうすめ、分光光度計にてＤＮＡ濃度の測定及びＡ２６０／２８０比による品質確認を行った。
組換え大腸菌からのプラスミドＤＮＡ抽出を２回行った結果、ＤＮＡの純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９４４から１．９７２であり、プラスミドＤＮＡの純度は良好であった。また、収量は、２回の抽出物を合わせて、５μｇ以上であった。
【０１０３】
制限酵素による切断
プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを用いて、ＢｃｕＩ単独での切断、ＢｇｌＩＩ単独での切断及びＢｃｕＩとＢｇｌＩＩの両者での切断を行った。反応条件は、酵素の製品説明書に従った。反応容量は２０μＬとした。
６コロニー株の全てについて、ＢｃｕＩ及びＢｇｌＩＩの２種酵素による切断で約７００ｂｐ及び約１．１ｋｂｐの２本のバンドが検出された。
また、ＢｃｕＩ或いはＢｇｌＩＩの単独酵素での切断では約１．８ｋｂｐの１本のバンドが検出された。これより、全株について、プラスミドサイズ、構成がデザインどおりになっている事が示唆された。
【０１０４】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記制限酵素で切断したプラスミドＤＮＡ溶液２０μＬに１０×loading buffer２μＬを加えよく混ぜ、これを常法に従って電気泳動を行った。
上記電気泳動で抽出したプラスミドを用いて、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitにてシーケンス反応を行った。シーケンスプライマーは、下記、表３のプライマーセット１及び２を用いた。
シーケンスのアライメントは、解析ソフトGENETY(R)ATSQ（株式会社ゼネティックス）を使用した。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号１）と比較した。
６株のうち、４株のプラスミド配列はデザインした配列番号１と一致したが、のこり２株のプラスミドには、それぞれ塩基の置換及び欠失があった。
配列番号１と一致した４株の中から１株を選択して、この株より抽出したプラスミドを「ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ」とした。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
［実施例２］
選択マーカー・活性蛋白質プラスミド（ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ）の構築（工程２）
（１）直鎖化プラスミドｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの調製
プラスミドの切断
ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉを制限酵素ＢｃｕＩ、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩにて以下のように切断した。ＸｈｏＩによる切断は、切れ残りプラスミドによる形質転換時のバックグランドを抑える為に行った。
ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ ５μｇに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２５μＬ、ＢｃｕＩを１００ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２５０μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し完全分解されたかどうかを、０．８％分析用アガロースゲルにて確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。切断確認後、酵素反応液よりタンパク質除去を行った。
【０１０７】
これに、１０×バッファＢａｍＨＩ（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢａｍＨＩを８０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにてＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。切断確認後、酵素反応液よりタンパク質除去を行った。
これに１０×Buffer R（酵素添付バッファー）を５０μＬ、ＸｈｏＩを４００ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて５００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、酵素反応液よりタンパク質除去を行った。
【０１０８】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したベクターを、実施例１記載の、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて７５分間電気泳動を行ってＤＮＡを分画し、約１．８ｋｂｐの目的バンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用した。分子量マーカーは、FastRular DNA ladder, Middle Range（Fermentas）を用いた。
【０１０９】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったベクターの一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。また、０．８％分析用アガロースゲルを用いて調製ベクターが約１．８ｋｂｐのシングルバンドであるか否かを確認した。
プラスミドｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの制限酵素処理、アガロースゲルからのＤＮＡ断片切り出し、精製を行った後のＤＮＡ断片について、アガロースゲル解析を行い、約１．８ｋｂｐのシングルバンドを確認した。吸光光度計でのＤＮＡ測定では、濃度が２１ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、２．０４９であった。
【０１１０】
（２）インサート（ＨＵ−ｅＣＤ断片）の調製
プラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献５：ＷＯ２００７／１３６１０７）より、ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（ビフィズス菌のＨＵタンパク質のＮ末端９アミノ酸と大腸菌由来のＣＤが融合した蛋白で、基質５−ＦＣとの親和性を高める変異が導入されている）、ＨＵプロモーター、ＨＵターミネーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
以下のように２段階のＰＣＲ（１ｓｔＰＣＲ及び２ｎｄＰＣＲ）を行い、ＨＵ−ｅＣＤ断片を調製した。
【０１１１】
１ｓｔＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
２種類の断片（ＨＵ−ｅＣＤ断片１及びＨＵ−ｅＣＤ断片２）のＰＣＲ増幅条件を検討した。
ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８ ５μＬ、５×PrimeSTARＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭｈ）４μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｆ３プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤinnerＲ１プライマー０．５μＬ、PrimeSTARＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、氷上にてＰＣＲ混合液（ＨＵ−ｅＣＤ断片１）を調製した。同様にして、この混合液を３チューブ調製した。
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数４】
【０１１２】
同様にして、ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤinnerＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｒ１プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、氷上にてＰＣＲ混合液（ＨＵ−ｅＣＤ断片２）を調製した。同様にして、この混合液を８チューブ調製した。
同様に、サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数５】
【０１１３】
ＰＣＲ終了後、各反応液を１本のチューブにまとめた。
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬ及び３μＬを用いてＰＣＲ産物の確認を行った。ＨＵ−ｅＣＤ断片１及び２の確認には、それぞれ０．８％分析用アガロースゲル及び２％分析用アガロースゲルを用いた。
ＨＵｅＣＤ断片１のＰＣＲ産物をアガロースゲル解析した結果、目的の約１．７ｋｂｐのシングルバンドの増幅を確認した。その収量は４．５μｇ以上であった。
また、ＨＵｅＣＤ断片２のＰＣＲ産物のアガロースゲル解析では、目的の約１５０ｂｐのシングルバンドの増幅が確認され、その収量は約８μｇであった。
【０１１４】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、QIAquick PCR purification kitの使用手順書に従って精製し、プライマーを除去した。精製の最終工程のＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる分画と切り出し
上記の精製ＰＣＲ産物を、上記、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画した。ＨＵ−ｅＣＤ断片１は、０．８％精製用アガロースゲルにて６５分間電気泳動を行い、約１．７ｋｂｐの目的バンドを切り出した。ＨＵ−ｅＣＤ断片２では、２％精製用アガロースゲルにて６５分間電気泳動を行い、約１５０ｂｐの目的バンドを切り出した。
【０１１５】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記、「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
精製ＰＣＲ産物の定量
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を用いて、０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、これを分光光度計にて定量した。ＨＵ−ｅＣＤ断片１及びＨＵ−ｅＣＤ断片２の濃度はともに４７ｎｇ／μＬ、収量が約２．３μｇであった。
【０１１６】
２ｎｄＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
上記のＨＵ−ｅＣＤ精製断片１及びＨＵ−ｅＣＤ精製断片２を鋳型に用いてこれらを連結させるＰＣＲ条件の検討を行った。
鋳型の調製
ＨＵ−ｅＣＤ精製断片１（約１．７ｋｂｐ）５１７ｎｇとＨＵ−ｅＣＤ精製断片２（約１５０ｂｐ）４７ｎｇを混ぜ、０．１×ＴＥにて１ｎｇ／μＬの濃度に調整した。両断片のモル比は１：１となる。
プライマー混合液の調製
２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｆ３プライマーと２０μＭ ＨＵｅＣＤ Ｒ１プライマーを１０μＬずつ等量混ぜた。
【０１１７】
ＰＣＲ混合液の調製
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１ｎｇ／μＬ Ｈｕ−ｅＣＤ断片１および２ミックス１μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ３２．５μＬを加え、氷上にて混合操作を行い、ＰＣＲ反応液を調製した、同様にして、この反応液を３本調製した。
【０１１８】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、９８℃で１０秒、７２℃で１００秒のサイクルを５サイクル行った後に、７２℃にて上記で調製したプライマー混合液を２μＬ添加混合し、サーマルサイクラーにて下記の反応を行った。反応終了後３本のＰＣＲチューブ内の反応液を１本のチューブにまとめた。
【数６】
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬ及び３μＬを、０．８％分析用アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド）を用いて電気泳動を行った。
２ｎｄＰＣＲ断片のアガロースゲル解析により目的の約１．８ｋｂｐのシングルバンドの増幅が確認された。その収量は約１３μｇであった。
【０１１９】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、QIAquick PCR purification kitの使用手順書に従って精製を行いプライマーを除去した。精製最終工程のＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥを５０μＬ用いた。
上記のプライマー除去したＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて５０倍に希釈し、これを分光光度計により定量した。
【０１２０】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＢａｍＨＩにて切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２５μＬ、ＢｃｕＩを１００ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２５０μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにて、ＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。電気泳動による確認の後、この酵素反応溶液よりタンパク質除去を行った。
これに、１０×バッファＢａｍＨＩ（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢａｍＨＩを８０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにてＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。電気泳動による確認の後、この酵素反応溶液をQIAquick PCR purification kitにて精製した。
【０１２１】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したＰＣＲ産物を、上記、「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画し、目的の約１．８ｋｂｐバンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用し、電気泳動開始から７５分後に、約１．８ｋｂｐの目的のバンドが、ゲルの１／３程度の場所に到達した時に電気泳動を終了した。ＤＮＡ分子量マーカーには、FastRular DNA ladder, Middle Range（Fermentas）を用いた。
【０１２２】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
上記、「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。また、０．８％分析用アガロースゲルを用いて電気泳動による確認をした。
上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理及びアガロースゲル精製後、吸光光度計で測定した結果、ＤＮＡ濃度は４１ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９３２であった。さらに、アガロースゲルでの電気泳動解析でも約１．８ｋｂｐのシングルバンドが認められた。
【０１２３】
（３）直鎖化ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉとＨＵ−ｅＣＤ断片のライゲーション
以下のようにして、ライゲーション反応液（反応液１）およびコントロール反応液（反応液２および反応液３）を調製した。
反応液１
０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、直鎖化ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（約１．８ｋｂｐ）とＨＵ−ｅＣＤ断片（約１．８ｋｂｐ）をモル比で１：３（重量比でも１：３となる）になるように、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（２１ｎｇ／μＬ）２．４μＬ（５０ｎｇ）、ＨＵ−ｅＣＤ断片（４１ｎｇ／μＬ）３．７μＬ（１５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ ８．９μＬを加え、氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液１）を調製した。
【０１２４】
反応液２
同様に、０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（２１ｎｇ／μＬ）２．４μＬ（５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ １２．６μＬを加え、氷上にて加え混和し、ｐＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉのみの反応液（反応液２）を調製した。
【０１２５】
反応液３
同様に、０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ＨＵ−ｅＣＤ断片（４１ｎｇ／μＬ）３．７μＬ（１５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および０．１×ＴＥ １１．３μＬを加え、氷上にて加え混和し、ＨＵ−ｅＣＤ断片のみの反応液（反応液３）を調製した。
【０１２６】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数７】
なお、反応液２及び反応液３により、切れ残りプラスミドに由来するバックグランドの割合を見積もった。
【０１２７】
（４）大腸菌の形質転換
上記ライゲーション反応後の溶液を１μＬ使用し、E.coli ＪＭ１０９の形質転換を、実施例１記載の「大腸菌の形質転換」と同様の方法で行った。
ベクターとインサートのライゲーション産物（ライゲーション反応液１）を用いた形質転換では、１０倍希釈菌液１００μＬあたり３４個及び３８個のコロニーが選択培地上に形成されたのに対し、ベクターのみをライゲーションしたコントロール反応液２及びインサートのみをライゲーションしたコントロール反応液３を用いた形質転換ではコロニーは０から１個であった。バックグランドが極めて低く、ライゲーション及び形質転換が良好に行われたことが示唆された。
【０１２８】
（５）プラスミドの確認
組換え大腸菌の培養
実施例１記載の「組換え大腸菌の培養」項に記載した方法に準じて行った。ただし、培養は２０．５時間行った。
プラスミドＤＮＡの抽出
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの抽出」項に記載した方法に準じて行った。
【０１２９】
プラスミドＤＮＡの濃度測定
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの濃度測定」項に記載した方法に準じて行った。
クローニングした全６株の組換え大腸菌からの抽出ＤＮＡの濃度を測定した結果、ＤＮＡの純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９０４から１．９１６であり、プラスミドＤＮＡの純度は良好であった。また、収量は５μｇ以上であった。
制限酵素による切断
プラスミドＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ＢｃｕＩ単独での切断、ＢａｍＨＩ単独での切断及びＢｃｕＩとＢａｍＨＩの両者での切断を行った。反応条件は、酵素の製品説明書に従った。反応容量は２０μＬとした。
【０１３０】
アガロースゲル電気泳動
分析用アガロースゲルは０．８％を用いて、アガロースゲル電気泳動を行った。
クローニング株６つ全てについて、ＢｃｕＩ及びＢａｍＨＩの２種酵素による切断で約１．８ｋｂｐの１本のバンドが検出された。また、ＢｃｕＩ或いはＢａｍＨＩの単独酵素での切断では約３．６ｋｂｐの１本のバンドが検出された。これより、全クローニング株について、プラスミドサイズ、構成がデザインどおりになっている事が示唆された。
【０１３１】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記で抽出のプラスミドを用いて、実施例１記載の「プラスミドのＤＮＡ配列確認」項と同様の方法にて配列決定を行った。プライマーには、実施例１記載の表３のプライマーセット１、２及び３を用いた。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号２）と比較した。
クローニング株全６株のプラスミド配列は、全て配列番号２と一致しており、全て目的の株が得られていることが確認された。全クローニング株の中から１株を選択し、この株より抽出したプラスミドを「ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ」とした。
【０１３２】
［実施例３］
シャトルプラスミド（ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ）の作製（工程３）
（１）直鎖化プラスミドｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの調製
プラスミドの切断
ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉを制限酵素ＢｃｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩにて以下のように切断した。ＨｉｎｄＩＩＩでの切断は、後の工程の形質転換時のバックグランドを抑える為に行った。
ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ ５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＳａｌＩを３４ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて６時間保温した後、その５０ｎｇを取り出し完全分解されたかどうかを０．８％分析用アガロースゲルにて確認した。
【０１３３】
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。ＳａｌＩでの切断を確認した後、この酵素反応液をQIAquick PCR purification kitにて精製した。
これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢｃｕＩを５０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、タンパク質を除去した。
これに、１０×Buffer R（酵素添付バッファー）を１０μＬｍ、ＨｉｎｄＩＩＩを２９ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、QIAquick PCR purification kitを用いてＤＮＡ溶液の精製及び濃縮を行った。
【０１３４】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したベクターを、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画し、約３．６ｋｂｐの目的バンドを切り出した。ただし、０．８％精製用アガロースゲルを用いて、５０Ｖにて９０分間電気泳動を行った。分子量マーカーには、Quick-Load 1kbp DNA ladder（NEB）を用いた。
【０１３５】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったベクターの一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
プラスミドｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉの制限酵素処理、アガロースゲルでの精製後のＤＮＡ断片の吸光度を測定した結果、濃度は１３ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９６１であった。
【０１３６】
（２）ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子（インサート）の調製
ＰＣＲの鋳型に用いるｐＢＬＥＳ１００では、ＲｅｐＢ遺伝子のＯＲＦのＣ末端領域と推定ｍｅｍｂＢ遺伝子のＯＲＦのＮ末端領域が重複している。ｍｅｍｂＢのＯＲＦが翻訳されないよう、ｍｅｍｂＢの推定されるリボゾーム結合領域及び翻訳開始コドンＡＴＧを別の塩基に変更した。ただし、その際にＲｅｐＢのアミノ酸変更は伴わない設計とした。以下のように２段階のＰＣＲ（１ｓｔＰＣＲおよび２ｎｄＰＣＲ）を行い、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子を調製した。
【０１３７】
１ｓｔＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
２種類の断片（ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１及びＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２）のＰＣＲ増幅条件を検討した。
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１
ｐＢＬＥＳ１００を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＢＬＥＳ１００ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０ μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐinnerＲ１プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。同様にして、この混合液を３本調製した。
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数８】
【０１３８】
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２
同様に、ｐＢＬＥＳ１００を鋳型に用いて、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１０ｐｇ／ｍＬ ｐＢＬＥＳ１００ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐinnerＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＲ１プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。同様にして、この混合液を３本調製した。
【０１３９】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せ、ＰＣＲを行った。
【数９】
ＰＣＲ終了後の反応液各１μＬを用いてＰＣＲ産物の確認および収量見積りを行った。ゲルは２％分析用アガロースゲルを用いた。
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１のＰＣＲ産物をアガロースゲル解析した結果、目的の約１．３ｋｂｐのシングルバンドの増幅を確認した。その収量は約４．５μｇであった。
また、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２のＰＣＲ産物のアガロースゲル解析では、目的の約４００ｂｐのシングルバンドの増幅が確認され、その収量は約４．５μｇであった。
【０１４０】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、定法（QIAquick PCR purification kit使用手順書）に従って精製及び濃縮した。
ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる分画と切り出し
上記の精製、濃縮したＰＣＲ産物を、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画した。ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１では、０．８％精製用アガロースゲルにて８０分間電気泳動を行った。目的の約１．３ｋｂｐのバンドがゲルの１／２程度のところに到達した時に電気泳動を終了した。分子量マーカーには、FastRular DNA ladder, Middle Rangeを用いた。一方ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２では、２％精製用アガロースゲルにて８０分間電気泳動を行った。目的の約４００ｂｐのバンドがゲルの１／２程度のところに到達した時に電気泳動を終了した。分子量マーカーには、FastRular DNA ladder, Low Rangeを用いた。
【０１４１】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
精製ＰＣＲ産物の定量
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて４倍に希釈し、これを分光光度計にて定量した。
上記アガロースゲル精製後のＰＣＲ産物について、吸光光度計で測定を行った結果、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子１及びＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子２の濃度はそれぞれ３７ｎｇ／μＬ及び６７ｎｇ／μＬであった。
【０１４２】
２ｎｄＰＣＲ
ＰＣＲ増幅の条件検討
上記のＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片１及びＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片２を鋳型に用いてこれらを連結させるＰＣＲ条件の検討を行った。
鋳型の調製
ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片１（約１．３ｋｂｐ）３２５ｎｇとＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片２（約４００ｂｐ）１００ｎｇを混ぜ、０．１×ＴＥにて１ｎｇ／μＬの濃度に調整した。ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片１とＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ精製断片２の混合比は、モル比で１：１になる。
【０１４３】
プライマー混合液の調製
２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＦ１プライマーと２０μＭ ＯｒｉＶ−ｒｅｐouterＲ１プライマーを等量混ぜた。
ＰＣＲ混合液の調製
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、１ｎｇ／μＬ ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ １および２ミックス１μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、PrimeStarＨ ＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ３２．５μＬを加え、氷上にて混合操作を行い、反応液を調製した。同様にして、この混合液を３本調製した。
【０１４４】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せた。
９８℃で１０秒、７２℃で７０秒のサイクルを５サイクル行った後に、７２℃にて上記で調製したプライマー混合液を２μＬを添加混合し、サーマルサイクラーにて下記の反応を行った。
【数１０】
ＰＣＲ終了後の反応液０．５μＬ及び１μＬを用いて、０．８％分析用アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー（０．５μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド）にて電気泳動を行った。
２ｎｄＰＣＲ断片のアガロースゲル解析により目的の約１．６ｋｂｐのシングルバンドの増幅が確認された。その収量は６μｇ以上であった。
【０１４５】
PCR purification kitによる精製
上記のＰＣＲ産物を、QIAquick PCR purification kitの使用手順書に従い精製してプライマーを除去した。精製の最終工程のＤＮＡ溶出には０．１×ＴＥ ５０μＬを用いた。
上記のプライマー除去したＰＣＲ産物の一部を用いて０．１×ＴＥにて２０倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
【０１４６】
ＰＣＲ産物の制限酵素処理
上記の精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｕＩ及びＳａｌＩにて切断した。
精製ＰＣＲ産物５μｇに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＳａｌＩを２５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとした。３７℃にて６時間保温した後、その５０ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにて、ＤＮＡの内部分解が起こっていない事を確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。電気泳動による確認後、QIAquick PCR purification kitを用いてＤＮＡの精製を行った。
これに、１０×Buffer Tango（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢｃｕＩを１１０ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとした。３７℃にて２時間保温した後、タンパク質の除去を行った。
【０１４７】
ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したＰＣＲ産物を、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて分画し、目的の約１．６ｋｂｐバンドを切り出した。ただし、ゲルは０．８％精製用アガロースゲルを使用し、電気泳動開始から９０分後に、約１．６ｋｂｐの目的のバンドが、ゲルの１／３程度の場所に到達した時に電気泳動を終了した。分子量マーカーには、Quick-Load 1kb DNA Ladder（NEB）を用いた。
【０１４８】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記の精製ＰＣＲ産物の一部を０．１×ＴＥにて３倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
上記制限酵素処理及びアガロースゲル精製後のＰＣＲ産物を吸光光度計で測定した結果、ＤＮＡ濃度は１６ｎｇ／μＬであった。また、純度を示すＡ２６０／２８０比は、２．０４１であった。
【０１４９】
（３）直鎖化ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉとＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子のライゲーション
以下のようにして、ライゲーション反応液（反応液１）およびコントロールの反応液（反応液２および反応液３）を調製した。
反応液１
滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、直鎖化ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（約３．６ｋｂｐ）とＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子（約１．６ｋｂｐ）をモル比で１：３（重量比では１：１．３となる）になるように、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（１３ｎｇ／μＬ）３．８μＬ（５０ｎｇ）、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ断片（１６．５ｎｇ／μＬ）３．９μＬ（６５ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ ７．３μＬを氷上にて加え混和し、ライゲーション反応液（反応液１）を調製した。
【０１５０】
反応液２
同様に、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉ（１３ｎｇ／μＬ）３．８μＬ（５０ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ １１．２μＬを氷上にて加え混和し、ｐＨＵ−ｅＣＤｍ−ＳＰＣＭ−ｐＵＣｏｒｉのみの反応液（反応液２）を調製した。
【０１５１】
反応液３
同様に、滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ断片（１６．５ｎｇ／μＬ） ３．９μＬ（６５ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ １１．１μＬを氷上にて加え混和し、ＯｒｉＶ−ＲｅｐＢ遺伝子のみの反応液（反応液３）を調製した。
【０１５２】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数１１】
反応液２により、切れ残りプラスミドに由来するバックグランドの割合を、反応液３により鋳型として用いたプラスミドＤＮＡの持込によるバックグランドの割合を見積もった。
【０１５３】
（４）大腸菌の形質転換
上記ライゲーション反応後の溶液を１μＬ使用し、E.coli ＪＭ１０９の形質転換を、実施例１記載の「大腸菌の形質転換」と同様の方法で行った。
ベクターとインサートのライゲーション産物（ライゲーション反応液１）を用いた形質転換では、形質転換後の菌懸濁原液１００μＬあたり２３８個及び２１６個のコロニーが選択培地上に形成されたのに対し、ベクターのみをライゲーションしたコントロール反応液２ではコロニーは検出されず、インサートのみをライゲーションしたコントロール反応液３を用いた形質転換ではコロニー数は８個及び６個であった。バックグランドが極めて低く、ライゲーション及び形質転換が良好に行われたことを示した。
【０１５４】
（５）プラスミドの確認
組換え大腸菌の培養
実施例１記載の「組換え大腸菌の培養」項に記載した方法にて行った。ただし、培養は２２．５時間行った。
プラスミドＤＮＡの抽出
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの抽出」項に記載した方法にて行った。
【０１５５】
プラスミドＤＮＡの濃度測定
実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの濃度測定」項に記載した方法にて行った。
ＤＮＡの純度を示すＡ２６０／２８０比は１．９５１から１．９５８であり、プラスミドＤＮＡの純度は良好であった。また、収量も１０μｇ以上得られた。
制限酵素による切断
プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを用いて、ＢｃｕＩ単独での切断、ＳａｌＩ単独での切断及びＢｃｕＩとＳａｌＩの両者での切断を行った。反応条件は、酵素の製品説明書に従った。反応容量は２０μＬとした。
【０１５６】
アガロースゲル電気泳動
実施例１記載の「アガロースゲル電気泳動」項に記載した方法にて行った。分析用アガロースゲルは０．８％を用いた。
候補株６つ全てについて、ＢｃｕＩ及びＳａｌＩの２種酵素による切断で約３．６ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐの２本のバンドが検出された。また、ＢｃｕＩ或いはＳａｌＩの単独酵素での切断では約５．２ｋｂｐの１本のバンドが検出された。これより、全候補株について、プラスミドサイズ及び構成がデザインどおりになっている事が示唆された。
【０１５７】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記で抽出のプラスミドを用いて、実施例１記載の「プラスミドのＤＮＡ配列確認」項と同様の方法にて配列決定を行った。プライマーには、実施例１記載の表３のプライマーセット１、２、３及び４を用いた。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号３）と比較した。
クローニング株全６株のうち、４株のプラスミド配列は、配列番号３と一致しており、目的の株が得られていることが確認された。残り２株はｐＴＢ６ ｒｅｐ ｕｎｉｔ内に一塩基欠失が見られた。配列番号３と一致した４株のうち１株を選択し、この株より抽出したプラスミドを「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」とした。
【０１５８】
（６）ビフィズス菌の形質転換
コンピテントセルの調製
Bifidobacterium longum Ｒｅ−１０５Ａグリセリンストックを室温にて融解し、よくまぜた。滅菌したガラスの試験管にＩＭＲ調整培地を１０ｍＬ入れ、これに融解菌液を１００μＬ加えよく混ぜた。これを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。
培養液１ｓｔをよく混ぜた後、その１００μＬを量り取り、ＩＭＲ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌し、これを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて１８時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１５９】
５０ｍＬ容の滅菌済みプラスティックチューブ（BD FalconＴＭチューブ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）４本にＩＭＲ調整培地を各３０ｍＬ分注した。これらのチューブを予め３７℃のインキュベータにて温めておき、これに培養液２ｎｄを各１．５ｍＬずつ加えよく混ぜた。キャップを軽く閉め、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて培養した。１時間３５分経過後、濁度（波長６００ｎｍ）０．２１３となった時に培養を終了し、培養液の入ったチューブを氷上に移した。これを、８０００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。クリーンベンチ内にて上清を捨て、菌体の入った各チューブに、予め氷中で冷やしたＰＢＳバッファー各５ｍＬを加え氷中にて穏やかに菌体を懸濁した。菌懸濁液の入ったチューブ４本を１本のチューブに纏め、これを８０００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心分離した。クリーンベンチ内で上清を捨て、菌体に予め氷中で冷やしたＫＭＲバッファー３６０μＬを加え再懸濁した。菌懸濁液は、約７２０μＬとなった。これを氷上にて一晩静置し、コンピテントセルとした。この一部を等量のＫＭＲバッファーにて２倍にうすめた菌懸濁液を調製し、これを２倍希釈コンピテントセルとした。
【０１６０】
形質転換
上記コンピテントセル８０μＬを予め氷冷した１．５ｍＬ容の滅菌済みマイクロチューブに入れた。これにｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを５７８ｎｇ（１μＬ）加え、ピペッティングにて穏やかに混ぜた後氷上に５分間置いた。ポジティブコントロールとして、ビフィズス菌B.longum Ｒｅ−１０５Ａで複製する事が実証済みのｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８を４９８ｎｇ（２μＬ）を上記と同様の手順にてコンピテントセルと混ぜた。同様に２倍希釈コンピテントセルとｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを５７８ｎｇ（１μＬ）を混ぜた。予め氷冷したキュベット（BM cuvettes, BM Equipment Co., Ltd.）に、上記の各混合液をそれぞれ移した。この時、ＤＮＡを添加していないコンピテンとセルのみも別のキュベットに加えた（ネガティブコントロール）。
エレクトロポレーションシステム（ジーンパルサーＩＩ、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を用いて形質転換（エレクトロポレーション）を行った。エレクトロポレーターは、ボルテージを２．０ｋＶ、キャパシタを２５μＦ、レジスタを２００Ωに設定し、本システムの取扱い説明書に従って操作した。
【０１６１】
電気ショック後は、キュベットにＩＭＲ液体培地８００μＬとビタミンＣ添加液５０μＬの混合液を即時に加え、これを滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに回収した。各チューブについて同様の操作を行い、これら２ｍＬチューブの蓋を開けてデシケータに入れた。デシケータ内の空気を真空ポンプにて脱気したのち、炭酸ガスを封入した。この操作を３回繰り返してデシケータ内の空気を炭酸ガスに置換した後、デシケータを３７℃に設定したインキュベータに入れ、３時間保温した。
保温後の各菌懸濁液をよく混ぜた後、その１００μＬを量り取り、ＩＭＲ寒天培地（７５μｇ／ｍＬ ＳＰＣＭを含有）２枚にそれぞれ塗抹した。これらのプレートを脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック(R)・ケンキ、三菱ガス化学株式会社）とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベータにて３日間培養した。
【０１６２】
コロニーの培養
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅによる形質転換コロニーを無作為に６個選び、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管にそれぞれ植菌した。コントロールとして、ＡＰＳ００１Ｃマスター・セル・バンクグリセリンストック（２００７．３．２２製造、シリアル番号：００４−０１２７）を室温にて融解し、その１００μＬを用いてＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。これら植菌後の試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。
培養液１ｓｔをよく混ぜた後、その１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。これらを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１６３】
プラスミド抽出
ＡＰＳ００１Ｃを除く上記培養液１ｓｔを２ｍＬ用いて、QIAprep Spin Miniprep Kitにてプラスミド抽出及び精製を行った。詳細は本キットの製品手順書に従った。
【０１６４】
プラスミドの確認（ＰＣＲ）
上記で抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、プラスミドの有無を確認した。滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、プラスミドＤＮＡ ５μＬ、５×PrimeStarＴＭbuffer１０μＬ、ｄＮＴＰmixture（各２．５ｍＭ）４μＬ、２０μＭチェックＦ１プライマー０．５μＬ、２０μＭチェックＲ２プライマー０．５μＬ、PrimeStarＨＳＤＮＡpolymerase０．５μＬ、および、０．１×ＴＥ ２９．５μＬを加え、ＰＣＲ混合液を氷上にて調製した。
ポジティブコントロールとして、大腸菌より抽出したプラスミドｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを１０ｐｇ／ｍＬの濃度に調製した溶液を鋳型にしたＰＣＲ混合液も同様に調製した。
【０１６５】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が９８℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数１２】
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬを用いてＰＣＲ産物の確認行った。ゲルは０．８％分析用アガロースゲルを用いた。
【０１６６】
［実施例４］
プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」の構築 （工程４）
（１）ｐＵＣ ｏｒｉ除去断片の調製
プラスミドの制限酵素による切断
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩにて以下のように切断した。
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ １０μｇに、１０×バッファＢａｍＨＩ（酵素添付バッファー）を２０μＬ、ＢａｍＨＩを６９ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて２００μＬとしよく混ぜた。３７℃にて３時間１０分保温した後、その５０ ｎｇを取り出し完全分解されたかどうかを、０．８％分析用アガロースゲルにて確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。ＢａｍＨＩでの切断を確認した後、この酵素反応溶液よりタンパク質除去を行った。
【０１６７】
これに、１０×Buffer O（酵素添付バッファー）を１０μＬ、ＢｇｌＩＩを４５ユニット加え全量を０．１×ＴＥにて１００μＬとしよく混ぜた。３７℃にて２時間保温した後、その１００ｎｇを取り出し、０．８％分析用アガロースゲルにて完全分解されたかどうかを確認した。
酵素反応液の入ったチューブは確認を待つ間氷上にて保存した。
制限酵素で切断したプラスミドＤＮＡ溶液１００ｎｇに０．１×ＴＥを加え全量を１０μＬとし、これに１０×loading buffer１μＬを加えよく混ぜる。これを電気泳動サンプルとする。ゲルは０．８％分析用アガロースゲルを用いた。
【０１６８】
アガロースゲルによる分画と切り出し
上記制限酵素で切断したベクターを、実施例１記載の「アガロースゲルによる分画と切り出し」と同様の方法にて１２０分間電気泳動を行い、約４．５ｋｂｐの目的のバンドが、約６５０ｂｐの不要バンドと十分に分離した事を確認した上で、約４．５ｋｂｐのＤＮＡバンドを切り出した。分子量マーカーには、Quick-Load 1kb DNA Ladderを用いた。
【０１６９】
アガロースゲルからのＤＮＡ溶出
実施例１記載の「アガロースゲルからのＤＮＡ溶出」と同様の方法にて上記切り出しゲルからＤＮＡを溶出した。
上記のアガロースゲル精製を行ったベクターの一部を０．１×ＴＥにて１５倍に希釈し、分光光度計にて定量した。
制限酵素によるｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅの切断、アガロースゲルによる精製を行った後、吸光光度計で測定した結果、ＤＮＡ濃度は４７ ｎｇ／μＬで、純度を示すＡ２６０／２８０比は、１．９３７であった。
【０１７０】
（２）精製したｐＵＣｏｒｉ除去断片のセルフライゲーション
ライゲーション反応
精製したｐＵＣｏｒｉ除去断片（約４．５ｋｂｐ）のセルフライゲーションを行った。滅菌済みの０．２ｍＬ ＰＣＲ用チューブ（Bio-BIK）に、５×Rapid Ligation Buffer ４μＬ、ｐＵＣｏｒｉ除去断片（４７ｎｇ／μＬ）１μＬ（４７ｎｇ）、５ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μＬ、および、０．１×ＴＥ １４μＬを氷上にて添加混和し、ライゲーション反応液を調製した。この反応液を２０本調製した。
【０１７１】
サーマルサイクラーを以下の条件に設定し、ブロックの温度が２２℃に達した後に上記チューブを載せた。
【数１３】
【０１７２】
精製（タンパク質除去及び濃縮）
上記ライゲーション反応液２０本を滅菌マイクロチューブ１本にまとめた後、タンパク質の除去を行った。ただし、ＤＮＡの溶解は、１０μＬの０．１×ＴＥにて行った。
【０１７３】
（３）ビフィズス菌の形質転換
形質転換
Bifidobacterium longum Ｒｅ−１０５Ａコンピテントセルの形質転換（エレクトロポレーション）を、上記精製ライゲーション反応産物５００ｎｇ（５μＬ）を用いて行った。バックグランドコントロールとしてライゲーション反応を行っていないｐＵＣｏｒｉ除去断片５００ｎｇ（１０μＬ）も同様に別チューブにてコンピテントセルと混ぜた。エレクトロポレーション操作は、実施例３記載の「形質転換」と同様の方法にて行った。
【０１７４】
コロニーの培養
精製ライゲーション反応産物にて形質転換を行ったコロニーを無作為に８個選び、実施例３記載の「コロニーの培養」と同様の方法にて培養を行った。
プラスミド抽出
上記培養液１ｓｔを１．５ｍＬ用いて、実施例１記載の「プラスミドＤＮＡの抽出」と同様の方法にてプラスミド抽出及び精製を行った。
【０１７５】
プラスミドの確認（ＰＣＲ）
上記で抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型に用いて、実施例３記載の「プラスミドの確認」と同様の方法にてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ終了後の反応液１μＬを用いてＰＣＲ産物の確認を行った。ゲルは０．８％及び２％分析用アガロースゲルの２種類を用いた。
【０１７６】
（４）プラスミドの配列確認
培養
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株のグリセリンストックを融解し、よく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。培養液１ｓｔをよく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管２本にそれぞれ植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１７７】
プラスミド抽出
上記培養液２ｎｄを適量用いて、QIAprep Spin Miniprep Kitにてプラスミド抽出及び精製を以下のように行った。
培養液２ｎｄを２．５ｍＬずつ４本の１５ｍＬ容プラスティックチューブ（BD FalconＴＭ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に入れ、各チューブに３０ｍＭ ＧＴＡバッファを７．５ｍＬ加えた。これを混ぜた後、１２０００ｒｐｍで１５分間２５℃にて遠心分離を行い、その上清をピペッティングにて捨てた。チューブ内の菌体に３０ｍＭ ＧＴＡバッファを１０ｍＬ加え混ぜた後、１２０００ｒｐｍで１５分間２５℃にて遠心分離を行い、その上清をピペットにて捨てた。菌体の入ったチューブ２本分を１本にまとめた後、これにＮ−アセチルムラミディス溶液（生化学工業株式会社製のＮ−アセチルムラミディス凍結乾燥品に、３０ｍＭ ＧＴＡバッファを加え３０００ユニット／ｍＬに調製した）を１ｍＬずつ加えよく混ぜた。このチューブを５０℃に設定したウォーターバスにて３時間保温した後に、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（キアゲン株式会社）を２５０μＬ加えよく混ぜ、６０℃に設定したウォーターバスにて３０分間保温した。ここで２本のチューブを１本にまとめた。
【０１７８】
これに、等量のバッファＰ１（キット添付）を加え混和した（Ａ）。この混和物を４本の１５ｍＬ容プラスティックチューブに分け、これにＡと等量のLysis溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ／２％ＳＤＳ）を加え転倒混和し、続いてＡの１．４倍容量のバッファＮ３（キット添付）を加え転倒混和して、菌体の溶菌、ついで中和を行った。１２０００ｒｐｍにて１５分間２５℃にて遠心分離を行った後、その上清を１５ｍＬ容プラスティックチューブに回収した。この回収液をQIAquick Spin Column（キット添付）８本を使用して精製した。精製方法は、同キットの手順書に従った。最終工程のＤＮＡ溶出は、５０μＬの０．１×ＴＥにて行い、約４００μＬのプラスミド溶液を得た。
【０１７９】
プラスミドのＤＮＡ配列確認
上記で抽出したプラスミドを用いて、実施例１記載の「プラスミドのＤＮＡ配列確認」項と同様の方法にて配列決定を行った。プライマーには、実施例１記載の表３のプライマーセット１、３及び４を用いた。アライメント後のプラスミド塩基配列をデザインした配列（配列番号４）と比較した。
クローニング株より抽出したプラスミドの全長シーケンスを決定した結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤのプラスミド配列は、配列番号４と一致していた。このクローニング株より抽出したプラスミドを「ｐＢｉｆｉＣＤ」とした。
【０１８０】
［試験例１］
ビフィズス菌の形質転換及びその基本特性の確認
（１）B.longum Ｒｅ−１０５Ａの形質転換の確認
ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅよりｐＵＣｏｒｉ部分を除去後閉環したセルフライゲーション産物及びｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅを用いたB.longum Ｒｅ−１０５Ａの形質転換結果を確認した。
プレート１から５は、同じコンピテントセルを使用した。プラスミドを加えていないネガティブコントロール（プレート番号１）ではコロニー数は１個及び０個であった。
しかし、ビフィズス菌中で複製される事が既に実証されているシャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（特許文献５；ＷＯ ２００７−１３６１０７）を用いて形質転換したポジティブコントロール（プレート５）でもコロニー数が５個及び２個であり、ネガティブコントロールとの数の差が小さかった。この事より、プレート１から５に使用したコンピテントセルの形質転換の効率は低いと考えられた。
【０１８１】
一方、プレート６では、コンピテントセル濃度を２倍にうすめたものを使用しており、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅにて形質転換を行った際に、プレート１枚あたり５００個以上のコロニーが形成された。プレート６に対するネガティブコントロールを実施していないが、プレート６上のコロニーがプラスミドｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅにて形質転換されている可能性が高いと考えられた。また、コンピテントセルの濃度が形質転換効率に大きく寄与している事が分かった。
また、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅよりｐＵＣｏｒｉを除去した断片のライゲーションを行った場合と行わなかった場合で、それらでの形質転換結果（それぞれプレート３及び４）は、プレート３で３個及び８個、プレート４で１個及び２個とコロニー数が何れも少なかった。
結果を表４に示した。
【０１８２】
【表４】
【０１８３】
（２）B.longum Ｒｅ−１０５Ａ形質転換体のプラスミド確認
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株８つ及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株６つより抽出したプラスミドを鋳型に用いてチェックプライマーでのＰＣＲを行った結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株では約５００ｂｐの増幅産物が検出された。また、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株では、１．１ｋｂｐの増幅産物が検出された。これよりクローニング株全てがプラスミドを有している事を確認した。また、ｐＢｉｆｉＣＤがｐＵＣｏｒｉ断片を含んでいない事が示された。
【０１８４】
［試験例２］
シトシン・デアミナーゼ活性の確認
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株８株及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株６株を用いてシトシン・デアミナーゼ（ＣＤ）活性の確認を行った。
ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調製培地での培養液２ｎｄ各１ｍＬ用いて、トリスバッファ（ｐＨ８．４）で３回洗浄後、超音波破砕し総タンパク質を抽出した。Ｌｏｗｒｙ法変法にて総タンパク質量を定量し、５μｇの総タンパク質を用いて、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を基質とした酵素反応を行った。酵素反応で生じた５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、残存の５−ＦＣ量を液体クロマトグラフィーにて定量し、ＣＤ酵素活性を算出した。
【０１８５】
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株のＣＤ活性を測定した結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株８株のＣＤ活性は８．０７〜１０．２９（平均：８．７４）ユニット／μｇ総タンパク質で、菌株による差は殆どなかった。
また、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株６株のＣＤ活性は８．１３〜９．６６（平均：８．６９）ユニット／μｇ総タンパク質で、同様に菌株による差は殆どなかった。
両クローニング株のＣＤ活性はほぼ同等であるものの、平均値ではB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株のＣＤ活性が僅かながら強く、ｐＵＣｏｒｉ断片の除去によるＣＤ活性の低下はなく、むしろ良好に作用していることが示唆された。
この試験により、ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ及びｐＢｉｆｉＣＤがビフィズス菌中で複製し、充分なＣＤ活性を有する事が実証された。測定結果は、表５に示すとおりである。
【０１８６】
【表５】
【０１８７】
［試験例３］
プラスミド保持安定性の確認
スペクチノマイシン入りの培地での培養で充分に活性化した培養液を、スペクチノマイシン非添加の培地にて培養を行った際のプラスミド保持安定性を以下のように確認した。
【０１８８】
ＳＰＣＭ添加培地での選択培養
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株２株のグリセリンストック及びB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株１株のグリセリンストックを融解し、よく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管に植菌した。ＡＰＳ００１Ｃ ＭＣＢ（シリアル番号００４−０１１６）についても同様の操作にて植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液１ｓｔ）。培養液１ｓｔをよく混和した後にその１００μＬを量り取り、ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地１０ｍＬの入った試験管２本にそれぞれ植菌した。これら試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃にて２４時間静置培養した（培養液２ｎｄ）。
【０１８９】
ＳＰＣＭ非添加培地での非選択培養
ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ非選択調製培地の入った１０ｍＬ試験管を予め３７℃に設定した水浴中にて温めた後、クリーンベンチ内で、この培地に上記のＳＰＣＭ添加培地での培養液２ｎｄを１０μＬずつ植菌した（０．１％植菌）。植菌後の各試験管を脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器にいれ、３７℃に設定したインキュベータに入れた。これら一連の操作は迅速に行い、培地の温度変化を出来るだけ少なくした。これら試験管を２４時間培養した後、各培養液を接種菌液として同様の方法にてＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ非選択調製培地への継代を繰り返した。
ＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ非選択調整培地での３回目の継代培養液をよく振り混ぜた後、その１００μＬを量りとり、嫌気性希釈液９．９ｍＬに加えよく混ぜた（１０２倍希釈液）。この１０２倍希釈液を同様の方法にて薄めて１０４倍希釈液、次いで１０６倍希釈液を調製した。この１０６倍希釈液を１００μＬずつＢＬ寒天培地５枚に塗抹した。これらのプレートを脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器にいれ、３７℃に設定したインキュベータにて２日間嫌気培養を行った。
【０１９０】
ＢＬ−ｂＳ寒天培地へのレプリカ
上記のＢＬ寒天培地より、よく分離したコロニー３００個を無作為に選別し使用した。滅菌した爪楊枝にてコロニーを釣菌し、ＢＬ−ｂＳ寒天培地、ＢＬ寒天培地の順に植菌した。これを各寒天培地１枚に対し５０個、計６枚に植菌した。植菌後の寒天培地は密閉容器にその容積に応じた脱酸素・炭酸ガス発生剤と共に入れ嫌気状態にし、３７℃で１日間培養した。
【０１９１】
培養終了後の計測は、爪楊枝による穿刺跡に明らかな菌の増殖が見られないものに印をつけ、それ以外の菌の増殖が見られたものをカウントした。プラスミドを保持する菌は、ＳＰＣＭ耐性であるので、プラスミド保持菌率は、ＳＰＣＭ耐性菌率として示される。プラスミド保持菌率を以下の式によって求めた。
【数１４】
【０１９２】
プラスミド保持安定性を測定した結果、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株＃１及び＃５のスペクチノマイシン耐性菌比率、すなわちプラスミド保持菌比率はともに８７．７％で極めて高い値を示した。
また、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅでは、プラスミド保持菌比率は８０．３％であった。
一方、シャトルプラスミドｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８で形質転換したB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８（ＡＰＳ００１Ｃ：特許文献６；ＷＯ ２００７−１３６１０７）のプラスミド保持菌比率は７１．７％であり、本発明のB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤのプラスミド保持菌比率より大きく下回る結果であった。
【０１９３】
本発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤは、ビフィズス菌B.longum Ｒｅ−１０５Ａ内で安定に保持され、本発明のプラスミドｐＢｉｆｉＣＤで形質転換したB.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤは極めて高いプラスミドの保持安定性を示すことが確認された。
また、両クローニング株共、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＡＶ００１−ＨＵ−ｅＣＤ−Ｍ９６８に比べ、極めて良好なプラスミド保持菌比率を示し、しかも、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株は、B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅクローニング株に比べプラスミド保持菌比率が高く、ｐＵＣｏｒｉ断片の除去により、プラスミド保持菌比率が向上していることが確認された。
測定結果を表６に示した。
【０１９４】
【表６】
【０１９５】
［試験例４］
プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」による大腸菌形質転換可否の確認
本願発明のプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」によって大腸菌が形質転換されない事を、シャトルプラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」を対照に用いて、以下のようにして確認した。
（１）プラスミドの調製
以下に示すようにして、本発明プラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」及び対照プラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」を調製した。
【０１９６】
培養
実施例４で作製したプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」による形質転換ビフィズス菌（B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ）をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に１％植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ３７℃て２４時間培養した。これを良く混ぜた後、その１％をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に植菌し同様に２４時間培養した。
同様に、実施例３で作製したシャトルプラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」による形質転換ビフィズス菌（B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ）をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に１％植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ３７℃て２４時間培養した。これを良く混ぜた後、その１％をＡＰＳ−２Ｓ−２．５Ｒ調整培地に植菌し同様に２４時間培養した。
【０１９７】
プラスミド抽出
上記培養液各２ｍＬを用いて、３０ｍＭ ＧＴＡバッファー（ｐＨ５．５）にて２回洗浄し、Ｎアセチルムラミダーゼ処理次いでプロテイナーゼＫ処理を行なった。これをQIAprep Spin Miniprep Kitにて精製し、それぞれのプラスミドＤＮＡを抽出した結果、それぞれ、約９μｇのプラスミドＤＮＡを得た。
【０１９８】
（２）大腸菌の形質転換
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（タカラバイオ株式会社）（１００μＬ）を上記で調製したプラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」及び「ｐＢｉｆｉＣＤ」を各５０ｎｇ（１μＬ）用いて熱ショック法によりそれぞれ形質転換を行った。形質転換方法は、コンピテントセル付属の製品説明書に従った。
熱ショック次いでＳＯＣ培地添加保温後の菌懸濁液をＬＢ寒天培地（７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含む）２枚に１００μＬずつ塗布後、３７℃にて一晩培養した。
【０１９９】
培養後の各プレート上のコロニーの有無を確認した結果、対照プラスミド「ｐＣＤｓｈｕｔｔｌｅ」を用いた大腸菌の形質転換でのみコロニーを検出した。
一方、プラスミドの代わりに０．１×ＴＥを混ぜた陰性コントロール及び本発明のプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」では、形質転換後にコロニーが検出されなかった。
本発明のプラスミド「ｐＢｉｆｉＣＤ」は、例えプラスミドが強制的に大腸菌に導入されたとしても、大腸菌内で複製できない事が確認された。
結果は、表７に示すとおりである。
【０２００】
【表７】
【０２０１】
［試験例５］
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株の抗腫瘍効果の確認
（１）B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株培養生菌（被検薬）の調製
B.longum Ｒｅ−１０５Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤクローニング株のグリセリンストックを常温にて融解し、適量を、炭酸カルシウム添加液体培地を入れた試験管に植菌し、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れて、３７℃インキュベータにて２４時間嫌気培養して活性化培養を行った。次いでこの培養液適量を、炭酸カルシウム非添加液体培地を入れた試験管に植菌し、同様の嫌気条件下で１８時間培養した（本培養）。
【０２０２】
培養液を５０ｍＬ容のポリプロピレン製コニカルチューブ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に移し混和し、この培養混合液５ｍＬを４倍量（２０ｍＬ）の冷却（５℃）生理食塩水に加え良く混和したものを３本調製した。 各チューブを８，０００ｒｐｍで１０分間冷却（４℃）遠心し、上清を除去した後、再度冷却生理食塩水２０ｍＬを加えて菌を懸濁することにより洗浄を行った（洗浄操作１）。この洗浄操作を更に２回行い、合計３回の洗浄を行った菌液を１本のチューブにまとめた後、懸濁菌液の容量を６．５ｍＬに調製した。この洗浄菌懸濁液を８μｍのメンブランフィルター（ポリカーボネート、東洋濾紙株式会社、Ｋ８００Ａ０２５Ａ）でろ過し、回収したろ液（培養生菌液）の生菌を被験薬として使用した。
【０２０３】
（２） 移植腫瘍細胞の培養
ヒト乳癌細胞株のＫＰＬ−１細胞は、５６℃で３０分間非動化したＦＢＳ（１０ｖ／ｖ％）及びペニシリン（５００００ Ｕ／ｍＬ）・ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を１ｖ／ｖ％添加したＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
コンフルエントとなった時点で１×ＰＢＳ（−）で洗浄後１×トリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を剥がし、遠心操作（１０００回転／５分間）で回収した細胞を、ＤＭＥＭ培地にて適宜希釈して継代培養した。
移植実験には５回継代後の細胞を用いた。トリパンブルーで染色されない生細胞数をThoma血球計算盤（Thoma deep 0.1 mm ERMA、東京）で計数し、ハンクス液に懸濁して細胞数を２．５×１０６個／ｍＬに調製した。
【０２０４】
（３） 担癌ヌードマウスの作製と腫瘍体積の測定
調製したＫＰＬ−１細胞懸濁液０．２ｍＬをヌードマウスの右前肢背部側の皮下に移植した（５×１０５個／マウス）。
移植後の腫瘍体積は、腫瘍径（長径、短径、厚み）をノギスで測定し、下式により求めた。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×厚み（ｍｍ）／２
【０２０５】
（４） 群分けと培養生菌（被験薬）、糖源（ラクツロース）およびプロドラッグ（５−ＦＣ）の投与
群分けと培養生菌（被験薬）の投与
ＫＰＬ−１担癌ヌードマウスの腫瘍体積が６０〜９５ｍｍ３程度のマウス１６匹を選別して、均等になるように２群（１群８匹）に分け、１群を対照群（無処置群）とし、もう１群を治療群とした。
治療群に、マウスあたり０．３ｍＬの培養生菌（被験薬）を１日に３回（ＡＭ／ＰＭ）、２日間（ｄａｙ１〜２）静脈内投与した。
培養生菌は、総投与容量として１．８ｍＬ、総投与菌数として５．９×１０９ｃｆｕ／マウスを投与した。
投与生菌数は以下のようにして測定した。
【０２０６】
生菌数測定
培養菌液を嫌気性希釈液で１０６倍に希釈し、その１００μＬをＢＬＦＳプレート各３枚に塗布し、密閉容器（アネロパック角型ジャー、三菱ガス化学）内に脱酸素・炭酸ガス発生剤と共に３７℃の恒温器で３日間嫌気培養した。コロニー数が３０〜３００程度検出されるプレートから下式により投与菌数を算出した。
投与菌数（ｃｆｕ）＝コロニー数（ａ）×プレート塗布時の希釈率（ｂ）×製剤１ｍＬ当たりの換算係数（ｃ）×投与量（ｍＬ）
（ａ）：（Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３）／３〔３プレート（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３）の平均コロニー数〕
（ｂ）：×１０６〔１０６倍希釈〕
（ｃ）：×１０〔１プレートあたり１００μＬを塗布〕
【０２０７】
ラクツロースの投与
治療群にはさらに、菌の糖源として、ラクツロース溶液を以下のように投与した。
２０％（ｗ／ｖ）になるよう精製水で溶解し１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌したラクツロース溶液１ｍＬをマウス腹腔内に１日に１回投与した。
投与期間は培養生菌投与終了翌日から２１日間（Ｄａｙ３〜２３）とした。
【０２０８】
フルシトシン（５−ＦＣ）の投与
５−ＦＣ溶液０．４ｍＬを、１日に３回（およそ９：００、１４：００、１８：００頃）マウスに経口投与した（総投与容量１．２ｍＬ）。
投与期間はＡＰＳ００１Ｆ培養生菌投与終了翌日から２１日間（Ｄａｙ３〜２３）とした。
【０２０９】
（５）腫瘍増殖抑制効果の確認
全てのマウスについて、治療開始前（群別け時）および治療開始後２４日間、３〜４日に１回の頻度で腫瘍径を測定し、腫瘍増殖に対する効果を確認した。
各群のマウスの腫瘍体積の平均値±ＳＤを算出し、対照群に対する相対腫瘍体積比率〔Ｔ／Ｃ（％）〕を指標として抗腫瘍効果を判定した。
対照群及び治療群の腫瘍体積（平均値±ＳＤ）を以下の表８に示す。
またこの時の経日的な腫瘍体積の変動を図５に示す。
試験終了日（ｄａｙ２４）での治療群の相対腫瘍体積比率〔Ｔ／Ｃ（％）〕は２３．０％であり、顕著な腫瘍増殖抑制活性が認められた。
【０２１０】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０２１１】
本発明の課題は、形質転換菌のみで複製され、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌では複製されない発現ベクターおよびその作製方法を提供することにある。また、本発明の課題は、該発現ベクターで形質転換された嫌気性微生物を含む遺伝子輸送担体、該遺伝子輸送担体を含有する医薬組成物、及び該形質転換菌を含有する固形腫瘍治療剤を提供することにある。
【０２１２】
本発明のベクターは、形質転換菌以外の菌、特に、大腸菌で機能する複製開始点を含まず、当該形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば大腸菌で複製されるおそれがない、極めて安全なベクターである。そして、本発明のベクターを用いて形質転換した遺伝子輸送担体は、プラスミド保持安定性が高く、さらに、形質転換菌以外の菌、特に、病原性または好気性若しくは通性嫌気性の菌、例えば、大腸菌への水平伝達を起こしたとしても、当該菌で複製されるおそれがなく、従って、極めて安全で、高品質の遺伝子輸送担体として期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物を形質転換するための、該嫌気性微生物において複製されるが大腸菌において複製されないプラスミドベクターであって、該嫌気性微生物において機能するが大腸菌において機能しないプラスミド複製ユニットを含む、前記プラスミドベクター。
【請求項２】
さらに、（１）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる蛋白質発現ユニットを含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種で機能するプラスミド複製ユニットである、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットである、請求項３に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが、ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子からなるｐＴＢ６ ｒｅｐユニットである、請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子からなるｐＴＢ６ ｒｅｐユニットをコードする遺伝子が、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、請求項５に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
目的とする活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
目的とする活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項９】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選ばれる一種である、請求項８に記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、請求項９に記載のプラスミドベクター。
【請求項１１】
配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ配列からなる、請求項１０に記載のプラスミドベクター（ｐＢｉｆｉＣＤ）。
【請求項１２】
嫌気性微生物を形質転換するための、該嫌気性微生物において複製されるが大腸菌において複製されない、該嫌気性微生物において機能するが大腸菌において機能しないプラスミド複製ユニットを含むプラスミドベクターの作製方法であって、（１）嫌気性微生物のプラスミド複製ユニットおよび大腸菌のプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに前記嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる蛋白質発現ユニットと、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットとを含む、前記嫌気性微生物と大腸菌とで相互複製されるシャトルプラスミドを作製し、該シャトルプラスミドから、大腸菌のプラスミド複製ユニットを除去することを含む、前記プラスミドベクターの作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載のプラスミドベクターで形質転換された嫌気性微生物からなる、遺伝子輸送担体。
【請求項１４】
嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種である、請求項１３に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１５】
嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１４に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１６】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムからなる群より選ばれる１種である、請求項１５に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１７】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項１６に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１８】
嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項１３に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１９】
嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項１８に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項２０】
遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）である、請求項１９に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する、医薬組成物または固形腫瘍治療剤。
【請求項１】
嫌気性微生物を形質転換するための、該嫌気性微生物において複製されるが大腸菌において複製されないプラスミドベクターであって、該嫌気性微生物において機能するが大腸菌において機能しないプラスミド複製ユニットを含む、前記プラスミドベクター。
【請求項２】
さらに、（１）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる蛋白質発現ユニットを含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種で機能するプラスミド複製ユニットである、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットである、請求項３に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが、ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子からなるｐＴＢ６ ｒｅｐユニットである、請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子からなるｐＴＢ６ ｒｅｐユニットをコードする遺伝子が、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、請求項５に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
目的とする活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
目的とする活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項９】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選ばれる一種である、請求項８に記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、請求項９に記載のプラスミドベクター。
【請求項１１】
配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ配列からなる、請求項１０に記載のプラスミドベクター（ｐＢｉｆｉＣＤ）。
【請求項１２】
嫌気性微生物を形質転換するための、該嫌気性微生物において複製されるが大腸菌において複製されない、該嫌気性微生物において機能するが大腸菌において機能しないプラスミド複製ユニットを含むプラスミドベクターの作製方法であって、（１）嫌気性微生物のプラスミド複製ユニットおよび大腸菌のプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに前記嫌気性微生物で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片からなる蛋白質発現ユニットと、（３）選択マーカー活性遺伝子ユニットとを含む、前記嫌気性微生物と大腸菌とで相互複製されるシャトルプラスミドを作製し、該シャトルプラスミドから、大腸菌のプラスミド複製ユニットを除去することを含む、前記プラスミドベクターの作製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載のプラスミドベクターで形質転換された嫌気性微生物からなる、遺伝子輸送担体。
【請求項１４】
嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる１種である、請求項１３に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１５】
嫌気性微生物が、ビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１４に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１６】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムからなる群より選ばれる１種である、請求項１５に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１７】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項１６に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１８】
嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、（ａ）抗腫瘍活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項１３に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１９】
嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項１８に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項２０】
遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−４９１）である、請求項１９に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する、医薬組成物または固形腫瘍治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５１７９２９（Ｐ２０１１−５１７９２９Ａ）
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１６３３（Ｐ２０１０−５４１６３３）
【出願日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００１７６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２８２７２
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５０４４３４０３９）株式会社アネロファーマ・サイエンス (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００１７６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２８２７２
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５０４４３４０３９）株式会社アネロファーマ・サイエンス (2)
【Ｆターム（参考）】
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